分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验归纳.pdfVIP

第三次分子生物学实验报告 重组质粒的酶切鉴定及 PCR 实验 一、实验目的 1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小； 2、学习并掌握 PCR技术的原理和基本操作。 二、实验原理 1 、重组质粒酶切鉴定 将含有外源 DNA 的转化子的 E.coliDH5 α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒 DNA， 将所提取的 DNA 用切 pUC19 质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源 DNA 的大小。 2 、PCR 原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是 1986 年由 Kallis Mullis 发现。这 项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析， 还可用于突变体和重组体的构建， 基因表达调控的研究， 基因多态性的分析等方面。 本次实 验旨在通过学习和掌握 PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。 （1）聚合酶链式反应原理 CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶 DNA 两侧的寡核苷酸引物， 经酶促合成特 异的 DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一 个循环，然后反复进行，使目的的 DNA 得以迅速扩增。置待扩增 DNA 于高温下解链成为 单链 DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链 互补结合， DNA 聚合酶在 72℃将单核苷酸从引物 3 端开始掺入， 沿模板 5— 3 方向延伸， 合 成 DNA 新链。由于每一循环所产生的 DNA 均能成为下一次循环的模板，所以 PCR 产物以 指数方式增加，经 25—30 次周期之后，理论上可增加 109 倍，实际上可增加 107 倍。 PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点， 但由于所用的 TaqDNA 聚合酶缺乏 5— 3 核酶外切酶活性， 不能纠正反应中发生的错误核苷 酸掺入，估计每 9000 个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的 作用倾向，使得错误不会扩大。 （2 ）PCR的反应动力学 PCR技术类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸 引物。 PCR由变性 --退火 --延伸三个基本反应步骤构成： ①模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93 ℃左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板 DNA 与引物的退火 (复性 ) ：模板 DNA 经加热变性成单链后， 温度降至 55℃左右， 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸： DNA 模板 -- 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半 保留复制链重复循环变性 --退火 --延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链” ，而且这种 新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达 平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的三个反应步骤反复进行， 使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可 用 Y＝(1