人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析.docVIP

人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 5 文2：人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性分析 6 1 材料和方法 7 2 结果 10 3 讨论 12 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 15 文章致谢（模板） 15 正文 人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析 文1：人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析 骨肉瘤是一种好发于长骨干骺端的恶性肿瘤。Rosen〔1〕提出新辅助化疗(neoadjuvant chemoherpy)的广泛应用，使骨肉瘤的5年生存率已达60%以上，但恶性肿瘤化疗后多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象仍是影响肿瘤患者化疗疗效和预后的主要因素之一。本研究以人成骨肉瘤细胞株MG63为诱导对象，分析其生物学特性。 1 材料与方法 材料 人骨肉瘤细胞株MG63购自上海 中国 科学 院细胞库。阿霉素(DXR，汕头明治医药有限公司)、DMEM(Gibco)、小牛血清(Calf Serum)(Gibco)、胰蛋白酶(Promega)、EDTA(Promega)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)。CO2孵箱(SANYO MCO17AIC，日本)、超净工作台(YZ875)苏净集团安泰公司，倒置显微镜(OLYMPUS，日本) 方法 主要溶液的配制 DMEM溶液：用950 ml去离子水溶解DMEM粉末 g，加入NaHCO3 g，HEPES g，调pH至，加入青霉素和链霉素，使最终使用浓度分别为100 U/ml和100 μg/ml，使用时加入胎牛血清至终浓度为10%。%胰蛋白酶%EDTA：称取 g EDTA，用去离子水溶解后，加入 g胰蛋白酶，定容至1 000 ml。 MG63培养与传代 MG63骨肉瘤细胞在含有10%小牛血清的高糖DMEM培养液(含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)中培养。隔日换液1次。约3 d长满后传代。按1∶3～5传代，继续培养。 MG63多药耐药细胞株亚系的建立 DXR加药浓度的确定：取96孔板，每孔接种5×103个细胞，培养24 h后分别加入终浓度为、、、、、、 ng/ml的DXR。继续培养48 h，观察细胞存活情况，确定起始加药DXR终浓度为 ng/ml。传代后将细胞分成实验组和对照组，实验组加入DXR终浓度 ng/ml，24 h后换液，约3 d细胞长满传代。对照组不加DXR，继续培养，约3 d传代。实验组细胞稳定生长后，逐渐加大DXR浓度，依次为、、、 ng/ml，每个浓度梯度持续1个月，细胞传代后稳定生长。整个诱导过程6个月，传代48次。将终浓度为、、 ng/ml的细胞分别命名为MG63/DXR10、MG63/DXR40和MG63/DXR100。 形态学观察 采用荧光倒置相差显微镜观察并照相。透射电镜观察对数生长期的MG63和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞。 细胞生长测定 将对数生长期的MG63和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞以1×104/ml细胞浓度接种于96孔培养板各3板，培养24 h后分别加入含长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺的培养液 (药物初始浓度分别长春新碱 μg/ml;氨甲蝶呤 5 μg/ml;环磷酰胺 μg/ml)，每种浓度设3个复孔，定为药物组;设以培养液换液的剩余3孔为对照组，继续培养48 h，加入5 mg/ml的MTT 20 μl,用酶标仪(λ=570 nm)测定每孔A值(A值与活细胞数成正比)，取其平均值， 计算 不同浓度的药物对肿瘤细胞的抑制率=(1-药物组A值/对照组A值)×100%。采用对数计量直线回归法计算出各种药物对细胞达50%抑制率时的药物浓度(IC50，单位μg/ml)，并计算耐药指数(RI)=IC50耐药细胞/IC50亲代细胞。将对数生长期的MG63和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞以浓度1×104/ml分别接种于96孔培养板，每组设3个复孔，24 h后每天以MTT法测定每组OD值，连续7 d，绘制生长曲线。 细胞周期及凋亡指数测定 分别收集耐药诱导期间同步传代的MG63和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞(1×107/ml),70%乙醇固定，采用10 mg/L溴化乙锭(EB)一步法插入DNA定量染色，流式细胞仪检测细胞周期，用Muticycle AV分析软