D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究临床医学.docVIP

D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 4 文2：D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究 5 1 材料与方法 5 2 结 果 7 3 讨 论 7 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 10 正文 D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究临床医学 文1：D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究临床医学 衰老的非酶糖基化理论认为糖基化造成的蛋白质的交联损伤是衰老的主要原因〔1，2〕，其反应在正常机体即缓慢进行，生物大分子无需酶的参加即可与氨基酸或核酸的氨基反应最终形成糖基化晚期终产物(AGE)〔3〕。研究表明随衰老在多种组织中出现AGE的增多，说明AGE在衰老及衰老相关疾病的发生机制中起一定的作用〔4～6〕，有些学者认为AGE可以作为衰老的生物学特征〔7〕。菟丝子常用作补益中药，药 理学 研究表明其具有补肾壮阳、提高机体免疫能力、调节内分泌、抗氧化等作用〔8～11〕。但关于菟丝子醇提液对衰老过程中AGE的影响及其作用机制国内外尚未见报道。本研究从衰老的非酶糖基化出发说明非酶糖基化与自由基代谢的关系及菟丝子对其作用，以进一步明确衰老的发生机制和菟丝子抗衰老作用的机制。 1 材料与方法 药品及实验动物 选用Wistar 雄性大鼠67只，体重180～220 g，由佳木斯大学动物实验中心提供(黑动字第)。菟丝子购自佳木斯华伟大药房，由本校生药教研室鉴定。菟丝子以8倍乙醇回流提取，旋转蒸发器回收乙醇，余液浓缩至含6 g生药/ml，盐酸镁粉实验鉴定菟丝子醇提液中所含成分。 动物分组及处理 将67只大鼠随机分为青年组10只，衰老模型组27只，其中15、30和45 d组各9只;模型给药组30只，又分为给药15、30和45 d组每天各10只;各组正常饮食，衰老模型组每日上午按48 mg/kg体重颈背部皮下注射D半乳糖，按 ml/100 g体重灌服温开水;模型给药组除按模型组注射D半乳糖外，每日按 ml提取液/100 g体重灌服菟丝子醇提液，各组眼球取全血，并行颈椎离断，取样液氮保存备用。 指标的测定 红细胞SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法;全血MDA含量和糖化血红蛋白(GHb)测定采用TBA比色法，测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠胸主动脉AGE受体(RAGE)表达水平测定：取胸主动脉100 mg液氮中迅速研磨成匀浆，转入装有1 ml预冷Trizol的EP管中，室温静置15 min，加入 ml氯仿，震荡30 s，冰上静置10 min后12 000 min,离心15 min，取上清液置另一管中，加等体积冷异丙醇，静置10 min，12 000 min离心10 min，弃上清，用70%乙醇洗2次后，4℃ 12 000 min，离心5 min，弃上清，真空离心干燥5～10 min，沉淀用水溶解。RNA样品处理：37%甲醛 μl，10×MOPS 2 μl，RNA样品溶液 μl，甲酰胺10 μl，混匀，68℃温育15 min，冰浴15 min，加入10×上样缓冲液2 μl混匀。采用电泳凝胶成像系统观察RNA分离情况和28 S rRNA与18 S rRNA的情况。采用DU800核酸蛋白检测仪测定RNA纯度。RTPCR法合成RAGE DNA：cDNA反应体系：引物选择Oligo dT18Adaptor Primer按程序操作，5×RNA PCR缓冲液5 μl，无RNA酶H2O μl，dNTP 混合物4 μl，RNA酶抑制剂 μl，AMV逆转录酶1 μl，Oligo dT上样引物1 μl，RNA样品2 μl，混匀，移入PCR仪，42℃ 60 min;95℃ 5 min;1循环。PCR反应：采用βactin作内参，引物5′GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′,5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′(扩增产物513 bp);RAGE引物5′ATGAGCAGAGCGGCTATTCC3′，5′CACGCTTCGGTCAGAGCTCA3′(扩增产物530 bp)。94℃ 5 min，1循环，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 80 s;34个循环，72℃ 7 min。PCR产物以凝胶成像系统扫描，测定光密度值并 计算 RAGE/βactin光密度比值。 统计学处理 采用统计分析软件，实验数据用x±s表示，进行方差分析