农杆菌转化原理及技术 .pptxVIP

农杆菌转化原理及技术水稻遗传转化已成为水稻分子生物学研究和遗传改良的重要技术基础几种常用植物基因转化方法的比较转化方法 农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求廉价廉价昂贵昂贵昂贵廉价工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛农杆菌介导法的优点操作简便外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝转移DNA片段明确可转移大片段DNA可直截了当用不同的植物组织进行基因转移 农杆菌介导遗传转化的原理农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌,分为发根农杆菌(导致毛状根的发生)和根癌农杆菌(导致冠瘿瘤,冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱)。根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒(Ti质粒)。根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区(Vir区)、结合区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区四个部分,其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。T-DNA区左右边界各有25bp的重复序列,其中14bp是核心,分10bp(CAGGAATATAT)和4bp(GTAA)不连续的两组,是完全保守的。Vir区为30Kb,由 VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH等七个操纵子共24个基因起共调控作用。Ti质粒结构示意图 农杆菌侵染过程 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG基因,再诱导Vir区的其他基因;Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移;T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上;T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素;农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该基因启动合成各种酶,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为惟一的碳源和氮源;冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti质粒的接合转移,扩大侵染范围根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因导入植物细胞并整合到核DNA上。Biology of A、 tumefaciensWell known to induce crown gall tumor A、tumefaciens lives around root surfaces (in rhizosphere)where it using nutrients that leak from the root tissuesinfects only through wound sites and actively chemotactic to themBacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone Plant wound produces acetosyringone Produce callus ? transform callus ? stimulate shooting by cytokinin addition+ cytokininThis procedure is easy for dicotyledone plants (legumes etc) 农杆菌介导转化水稻的方法水稻(籼稻)根癌农杆菌转化技术流程愈伤诱导NB培养基为基本培养基加入相应植物生长调节剂 共培养第一天(预培养)第三天(划菌)第五天(侵染、共培养)第八天(脱菌、筛选)整个操作过程约需8天抗性愈伤的筛选与再生成完整植株技术关键:诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织;用于转化的胚性愈伤的继代次数不超过8代;高密度根农杆菌液侵染与共培养;干燥处理;共培养后有效去除农杆菌或者抑制农杆菌生长(合适的抗生素及其浓度);快速筛选(2-3次筛选);迅速分化再生。 一、 培养基基本培养基为NB培养基,愈伤诱导、转化及分化等培养基配方如下:1、诱导培养基:NB+2,4-D2 mg·L-1 ;pH 5、8-5、9。2、预培养培养基:NB+2,4-D2 mg·L-1 ;pH 5、8-5、9。3、共培养培养基:NB+2,4-D2 mg·L-1 +AS100 μM·L-1 ;pH 5、2。4、选择培养基:NB+2,4-D 2mg·L-1 + 羧苄青霉素 250mg·L-1 + Hyg 30-50 mg·L-1 ,pH 5、8-5、9。5、分化培养基:NB+KT10mg·L-1+ NAA0、4 mg·L-1;pH 5、8-5、9。6、生根培养基:1/2MS ;pH 5、8-5、9。 二、胚性愈伤组织的诱导及继代 取水稻授粉后15-20d的未成熟穗,将未成熟种子剥壳,用75%乙醇浸泡1min,再转入25％的次氯