第七章蛋白质的分离歌纯化与表征.pptVIP

Logo 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量 。1.4克SDS/1克蛋白质。不同的蛋白质的SDS复合体具有几乎相同的荷质比。 二、蛋白质分子的大小与形状 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 二、蛋白质分子的大小与形状 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 蛋白质的胶体性质 　　稳定胶体具备3个条件： 1.分散相质点大小在1~100nm范围，这在动力学上是稳定的，可不断作布朗运动。 2.分散相质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集形成大颗粒而沉淀。 3.分散相能与溶剂形成溶剂化层，这样质点相互不易靠拢而聚集。 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (二) 蛋白质的沉淀 蛋白质的稳定性与质点大小、电荷和水化有关。 （1）盐析法：硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等。通常不引起蛋白质变性， 　　　　　　　去盐即可溶解。 (2)有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等。 (3)重金属盐沉淀法：pH＞pI时,蛋白质带负电荷，能与重金属离子作用而变性。 　　　　　　　　　　　　　　如（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等） (4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH＜pI时，蛋白质带正电荷，能与生物碱和酸根负离子作用生成不溶性盐，鞣酸、苦味酸、钨酸、KI；三氯醋酸、磺基水杨酸和硝酸等。　 (5)加热变性沉淀： 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 （1）前处理：细胞破碎，有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶等方法。 (2)粗分离：盐析、等电点沉淀有机溶剂法分离，用PEG浓缩。 (3)细分离：电泳、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等 (4)蛋白质结晶：蛋白质溶液略过饱和。 四、蛋白质分离纯化的一般原则 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 一般是根据蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、吸附性质和与配体分子的生物学亲和力等。 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 2.密度梯度(区带)离心 3.凝胶过滤 (1)凝胶过滤的介质 (2)凝胶过滤的原理 五、蛋白质的分离纯化方法 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 五、蛋白质的分离纯化方法 切向流过滤 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 五、蛋白质的分离纯化方法 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 2.密度梯度离心 常用氯化铯、蔗糖、聚蔗糖（Ficoll）、 (Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）等 五、蛋白质的分离纯化方法 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 3.凝胶过滤 常用Sephadex、聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂糖等，凝胶的粒度与洗脱流速 和分辨率有关，粒度常用筛眼数或 目数或珠直径。 五、蛋白质的分离纯化方法 凝胶柱床总体积(Total Volume,Vt): 某一溶质组分的洗脱体积(Elution Volum,Ve):自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）或洗脱峰上升边缘的半高点出现时所流出的体积。 孔隙体积(Void volume)或外体积(outer volume，Vo)或外水体积：存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。用蓝色葡聚糖－2000检测。 内体积(inner volume,Vi)或内水体积：凝胶珠内部的水相体积。用小分子的Ve-Vo。 凝胶基质体积(matrix volume，Vm) 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 3.凝胶过滤 五、蛋白质的分离纯化方法 溶质在柱中的移动速度取决于它在 两相之间的分配系数（Kd）: 可用分配系数（available coefficient,Kav）: 两种不同Mr和不同Kav值的组分洗脱体积差： 完全分开两种组分，样品的体积不能大于Vs 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (二) 根据溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀和pH控制 2.蛋白质的盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法 4.温度对蛋白质溶解度的影响 五、蛋白质的分离纯化方法 (三) 根据电荷不同的纯化方法 1.电泳(electrophoresis) 2.聚