基因芯片的操作流程及步骤.pptVIP

离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。 在RNase-Free 0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。 用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。 填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐 保留1-2张取材部位的病理切片。 第六十三页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 以上步骤应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。 对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。 第六十四页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 3.基因芯片杂交 第六十五页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然，常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用，但操作繁琐且费时。 高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。 为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。 用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。 第六十六页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 杂交条件的选择与研究目的有关，多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。 通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。 如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。 表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。 第六十七页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 第六十八页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 第六十九页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 第七十页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 4.基因芯片检测原理 第七十一页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。 由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。 此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。 杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。 第七十二页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 基因芯片的操作流程 第三十一页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 基因芯片流程（一） 1. 实验设计 2. 样品制备（指mRNA或总RNA样品，包括对照组和实验组。将mRNA或总RNA分别进行逆转录生成cDNA，然后将对照组和实验组cDNA分别标记Cy3和Cy5荧光信号） 3. 芯片制备（寡核苷酸探针或 cDNA探针，包括PCR，纯化，点样等步骤） 第三十二页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 例 基于芯片的基因测序 第三十三页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 基因芯片流程（二） 4. 芯片杂交（将用Cy3和Cy5荧光标记的对照组和实验组的cDNA 等量混合，与芯片进行杂交） 5. 芯片扫描（采用激光扫描仪，分别用532nm和635nm波长激光扫描芯片，对于每张芯片，得到Cy3和Cy5通道两幅图象） 第三十四页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 cDNA spotted microarrays 第三十五页，编辑于星期二：二十二点 三十三分。 基因芯片流程（三