EGFP-Wnt2融合蛋白抗原和Wnt2单克隆抗体以及Wnt2单克隆抗体的应用发明专利.docxVIP

EGFP-Wnt2融合蛋白抗原和Wnt2单克隆抗体以及Wnt2单克隆抗体的应用 技术领域 本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及EGFP-Wnt2融合蛋白抗原和Wnt2单克隆抗体以及Wnt2单克隆抗体的应用。 背景技术 实体肿瘤细胞的免疫逃逸是临床肿瘤免疫治疗和肿瘤免疫学基础研究的热点和难点之一。目前PD-1/PD-L1阻断抗体在实体肿瘤治疗的早期临床试验中展现了不错的潜力，然而免疫疗法往往会受制于实体肿瘤免疫微环境及其复杂的免疫逃逸调控，导致总响应率不高甚至耐药。深入探讨肿瘤免疫逃逸分子机制，寻找新的免疫治疗靶点，将为发展新型高效的肿瘤免疫疗法提供十分重要的指导意义。 目前，生物医学研究者越来越重视肿瘤微环境对肿瘤进展及治疗的作用，其中，肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)居重要地位。目前认为CAFs对肿瘤的演进起着促进作用，CAFs在肿瘤发生、进展、转移等各个过程中都产生重要的影响，可以通过肿瘤和非肿瘤成分促进肿瘤的演化。研究发现：靶向FAP?+CAFs分泌的CXCL12的治疗，可以促进T细胞的肿瘤浸润，从而有效增强PD-L1的免疫治疗效果，表明FAP?+CAFs可以通过释放CXCL12调节免疫抑制的微环境(Feig C et al,PNAS.2013)。此外，CAFs释放的FAP蛋白可以通过STAT3-CCL2信号通路促进MDSC的肿瘤浸润，从而抑制抗肿瘤免疫反应(Yang Xet al,Cancer Res.2016)。虽然CAFs目前已被证实可以调节肿瘤细胞的免疫逃逸，但由于肿瘤细胞发生免疫耐受的机制复杂，CAFs参与其中的分子调控网络仍有待进一步的发掘和阐明。 从食管癌患者的癌组织和癌旁组织中分别成功分离出CAFs和其相应的正常纤维母细胞(NFs)，并应用基因芯片比较分析了CAF和NF的基因表达差异。结果显示，126个基因在功能方面分别与细胞增殖(61个基因)，细胞外间质重构(40个基因)以及免疫反应(25个基因)有关。以往研究发现，Wnt2基因在食管鳞癌CAFs的表达显著上调(Zhang C et al,Clin Cancer Res.2009)，既往也有研究报道Wnt/β-catenin信号通路能够促进免疫逃逸,提示CAFs分泌的Wnt2蛋白可能参与实体肿瘤免疫抑制微环境的调控。此外，Wnt2也被报道在多种肿瘤组织中高表达，包括食管鳞癌(Fu et al,Gut.2010)胰腺癌(Yu M et al,Nature.2012)、结直肠癌(Kramer N et al，Oncogene.2017)、胃癌(Katoh M,Int JOncol.2001)、肺癌(Huang C et al,Am J Cancer Res.2015)、乳腺癌(Dale TC et al,Cancer Res.1996)等。综上所述，深入了解分泌性Wnt2蛋白的免疫调控机理，对于研发靶向Wnt2高表达肿瘤的新型免疫疗法、制定肿瘤风险评估以及预后判断的有效措施具有重要的临床意义。 发明内容 有鉴于此，本发明的目的是提供一种新的Wnt2单克隆抗体，该Wnt2单克隆抗体结合细胞分泌的人Wnt2抗原时，拮抗细胞对肿瘤内抑制性免疫微环境形成的促进，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸及生长。本发明提供的Wnt2单克隆抗体能够用于食管鳞癌、胃癌、胰腺癌、直肠结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、肝癌等实体肿瘤的免疫治疗中。 本发明通过以下技术手段解决上述技术问题： 在本发明的第一方面，提供了一种EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原主要是EGFP与人源Wnt2除信号肽的全长氨基酸序列的融合蛋白，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原包括EGFP氨基酸序列、TEV酶切位点和FLAG标签序列、Wnt2除信号肽全长氨基酸序列、6×His标签序列。 进一步，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 在本发明的第二方面，提供了一种核苷酸，所述核苷酸编码如上述第一方面所述的EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上述第二方面所述的核苷酸。 在本发明的第四方面，提供了EGFP-Wnt2融合蛋白抗原的制备方法，包括如下步骤： S1.将EGFP基因与除去ER信号肽的人源野生型Wnt2基因融合，在两个基因之间插入TEV酶切位点和FLAG标签序列，并在氨基端加上大鼠生长激素的ER信号肽，进行分泌表达，在Wnt2的羧基末端接上6×His标签，产生的序列的前后端加上一对限制性内切酶BamHI和SexA I，用于构建到慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，同时去除原有的Puro