柯萨奇病毒A7的病毒样颗粒及其制备方法和应用发明专利.docxVIP

柯萨奇病毒A7的病毒样颗粒及其制备方法和应用 技术领域 本发明属于生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A7的病毒样颗粒及其制备方法和应用。 背景技术 手足口病是由肠道病毒引起的传染病，在亚太地区呈周期性爆发，多数手足口病的患儿一周左右自愈，少数患儿可引起肺部并发症，心肌炎、无菌性脑膜脑炎等并发症，重症患儿病情发展快，短时间内可导致死亡。目前对手足口病缺乏有效治疗药物对症治疗，造成我国及周边国家严重的公共卫生问题。 EV，Enterovirus，肠道病毒，肠道病毒又称肠病毒，是一种主要寄生于肠道的单链正义RNA病毒，属于小RNA病毒科，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒等，与人类及哺乳动物的传染性疾病有关。肠道病毒在人群中感染主要表现为类流感症状、疱疹性咽峡炎及手足口病等症状。 CA，Coxsackievirus groups A，柯萨奇病毒A组，属于肠道病毒属，根据乳鼠感染的临床症状与组织病理特性分成A、B两组。A组目前包含24种血清型，与人类的手足口疾病主要相关。 目前已报道的可引起手足口病的肠道病毒有20多种(型)，包括肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)、CA10、CA6、CA4、CA7和CA14等，以EV71引起的重症居多。目前针对EV71引起的手足口病的疫苗已成功上市销售，对由EV71病毒引起的手足口病起到积极的预防作用，但肠道病毒A组病毒抗体之间没有交叉保护作用。CA7是除EV71和脊髓灰质炎病毒以外与弛缓性麻痹爆发相关的少数肠道病毒之一。 肠道病毒颗粒直径约为20～30nm，呈现20面体对称球形，无包膜。病毒衣壳蛋白内部包裹的一条单链正义RNA全长约7500bp，由一个开放阅读框(open reading frame，ORF)和两端的5’-和3’-非编码区(untranslated region，UTR)组成。ORF编码一个较大的多聚前体蛋白，由P1、P2、P3三个前体蛋白组成，P1编码病毒衣壳的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1包含主要的中和抗原表位所在的区域，P2、P3编码非结构蛋白，包括2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。肠道病毒家族的前体蛋白的剪切一般为ORF表达的多聚前体蛋白首先裂解为P1、P2、P3，P1经3CD蛋白等的作用继而裂解为各种衣壳蛋白VP0(约35kDa)、VP1(约32kDa)和VP3(约28kDa)，病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力，组装成病毒颗粒，VP0在核酸存在的情况下进一步裂解为VP2和VP4。肠道病毒一般采用适宜的载体序列同时表达P1和3CD蛋白，不需经过筛选纯培养病毒即可获得具有免疫原性的病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)。VLPs不含有病毒的核酸，因此不能自主复制，没有感染性，但其形态与天然状态下的病毒颗粒相同或相似，免疫后可通过和病毒感染相同的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。 然而，目前本领域还没有一种有效的针对柯萨奇病毒的理想疫苗。 发明内容 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案。 第一方面，本发明提供一种重组杆状病毒表达载体。 作为本发明的一个具体实施方式，本发明的重组杆状病毒表达载体具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或具有分别与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列互补的序列，或具有分别与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。 作为本发明的一个具体实施方式，所述表达载体进一步包含AcMNPV p10启动子和/或polyhedrin启动子。 第二方面，本发明提供一种柯萨奇病毒A7的病毒样颗粒的表达系统。 作为本发明的一个具体实施方式，本发明的柯萨奇病毒A7的病毒样颗粒的表达系统包含所述表达载体。 作为本发明的一个具体实施方式，所述表达系统为大肠杆菌或昆虫细胞，优选昆虫细胞。 作为本发明的一个优选的具体实施方式，所述昆虫细胞是Sf9昆虫细胞。 第三方面，本发明提供一种具有免疫原性的柯萨奇病毒A7的病毒样颗粒(CA7VLP)。 作为本发明的一个具体实施方式，本发明的具有免疫原性的柯萨奇病毒A7的病毒样颗粒具有：(1)：SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的P1蛋白和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的3CD蛋白，或(2)：在(1)中的SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列分别经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述病毒样颗粒的免疫原性的由(1)衍生的P1蛋白和3CD蛋白。 第四方面，本发明提供一种制备所述柯萨奇病毒A7