抗CD47单克隆抗体、片段及其医药用途发明专利.docxVIP

抗CD47单克隆抗体、片段及其医药用途 技术领域 本发明涉及一种能特异性结合CD47的高亲和力单克隆抗体，具体涉及所述单克隆抗体的制备方法，以及该单克隆抗体的可变区序列，同时涉及了该抗体在治疗肿瘤过程中的用途。 背景技术 CD47也被称为整合素相关蛋白(integrin-associatedprotein，IAP)，CD47为5次跨膜糖蛋白，其分子量为50KD,属于免疫球蛋白超家族一员。从空间结构来看，CD47分子由IgV的胞外结构域，5个高度疏水的跨膜片段构成和一个较短的胞内结构域。CD47自发现以来，被确认为多种肿瘤细胞表面抗原，在多种人类肿瘤细胞表面高表达，像人类卵巢癌、急性髓性白血病、慢性随性细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，非霍金森淋巴细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞表面均发现有CD47高表达，且CD47高表达与患者预后，生存率负相关，公开的研究表明CD47可作为治疗癌症的一个潜在靶点。CD47可与信号调节蛋白，血小板反应蛋白，整合素相互作用介导细胞增殖，凋亡以及吞噬作用调节。CD47与信号调节蛋白α互为受体和配体，相互作用，可形成CD47-SIRPα复合体。SIRPα属于免疫球蛋白超家族，主要表达在树突状细胞，巨噬细胞，中性粒细胞表面，其尾部含有免疫受体酪氨酸抑制剂基序immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs(ITIMs)，CD47-SIRPα结合，使得SIRPα胞内段尾部磷酸化，进而募集SHP1,SHP2传导免疫抑制信号，从而调节巨噬细胞的吞噬作用，肿瘤细胞借此机制通过高表达CD47，以“别吃我”信号，逃避了免疫系统的监视。通过使用抗CD47抗体，阻断CD47和SIRPa的相互作用的多肽，以及融合蛋白等方法阻断CD47和SIRPa的相互作用，具有靶向性治疗的意义。针对阻断CD47和SIRPa的相互作用的抗体以及融合蛋白多家制药公司已有布局，目前在临床阶段的有Forty Seven的Hu5F9-G4，Celgene的CC-90002以及Trillium的TTI-621，天境生物的TJC4,信达生物的IBI188，恒瑞医药的SHR-1603等。 本发明以重组人CD47胞外区(rhECD47)蛋白为抗原，通过杂交瘤技术，快速筛选系统制备得到具有高亲和力，高阻断作用的抗CD47特异性单克隆抗体，体外实验验证所得抗CD47单克隆抗体具有良好的生物活性和抗肿瘤活性。 发明内容 本发提供了一种新的CD47单克隆抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。 一方面，本发明提供了能特异性结合CD47的抗体或者其功能性片段。其中所述抗体含有重链和轻链。(I)其中所述抗体重链含有SEQ ID NO：58、59和60，或者SEQ ID NO：64、65和66，或者SEQ ID NO：70、71和72,或者SEQ ID NO：73、74和75或者SEQ ID NO：76、77和78的氨基酸序列HCDR1、HCDR2和HCDR3；(II)其中所述抗体轻链含有SEQ ID NO：61、62和63，或者SEQ ID NO：67、68和69，或者SEQ ID NO：79、80和81的氨基酸序列LCDR1、LCDR2和LCDR3。 本发明提供了所述抗体含有能够特异性结合CD47的抗体或功能性片段，(I)所述抗体重链包含具有SEQ ID NO：39、43、47、51和55的重链可变区氨基酸序列；(II)所述抗体轻链包含具有SEQ ID NO：41、45、49、53和57的轻链可变区氨基酸序列。 另一方面，本发明提供了能够编码特异性结合CD47的抗体和功能性片段的核苷酸序列，(I)所述编码抗体重链的核苷酸序列有包含具有SEQ ID NO：38、42、46、50、54；(II)所述编码抗体轻链的核苷酸序列有SEQ ID NO：40、44、48、52。 优选地，本发明的抗体选自克隆2D1，2D14，2D27，2D47，2D51。 本发明优选的方案中，所述抗原特异性结合片段可为Fab,scFV,(Fab’)2。 本发明以重组人CD47胞外区蛋白(购自北京义翘神州)作为免疫原，与小鼠快速免疫佐剂等体积混合免疫Bal b/c小鼠，三次免疫后检测血清效价，符合融合要求的，取小鼠脾细胞与sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过HAT条件培养筛选，稳定表达CD47蛋白HEK293细胞ELISA筛选，阻断作用快速筛选系统筛选，得到能稳定分泌抗CD47且具有阻断生物学功能抗体的杂交瘤细胞株，经亚克隆化及扩大培养后，通过分子克隆的方法分别调取抗体重链、轻链可变区序列并测序。通过向小鼠腹腔注射杂交瘤细胞产生腹水，再通过ProteinA/G亲和层析纯化制备单克隆抗体。通过体外一系列实验证明所述抗体为高亲和力，高特异性CD4