羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作PPT参考幻灯片.ppt

（2）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。 * （3）小心取出无菌实验用品，避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。 * （4）工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐物品伤人等。 * （5）定期检查下列项目：CO2 钢瓶内的CO2 压力；CO2 培养箱内的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA 过滤器滤膜，预滤网﹙300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA）。 * 人羊水细胞培养及染色体制备 人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可区分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。 * E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。 AF细胞在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。 F细胞在再培养中潜在的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。 * 通常在培养后3—4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合再培养作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可被用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。 * 实验用品、实验试剂 见实验操作手册 * 内容与方法 （一）细胞接种与培养 在无菌条件下抽得妊娠18-22周羊水后，注入10ml离心管中，共抽4管约32ml，立即送检 进室后，以1500rpm离心10min 进无菌室，在无菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml完全培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm2方形培养瓶中置含5%CO2的37℃温箱行开放式培养 * 一般5天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上换液用培养基，继续培养24-48小时，如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml, (20ug/ml，7号针头垂直加2滴)4-6小时左右行细胞学处理 * （二）细胞收获 倒出瓶中细胞液入10ml离心管，0.85%NaCl冲洗细胞壁两遍 0.25% EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞。 收集细胞悬液：离心，1500rpm，10min，去上清 * 低渗：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%柠檬酸钠1∶1作为低渗液,每管8ml，低渗10min)。 预固定：加入1.5ml左右，轻混匀37℃水浴5min， 离心,1500rpm,10min。 固定：加入3:1固定剂8ml左右，轻混匀，37℃水浴10min * 室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml 重复固定：同上 离心，1500rpm，10min，去上清 调悬液：视管底细胞量加入几滴新鲜固定剂，并吹打混匀 *