RNAi 技术原理参考.pptVIP

RNAi的实验方法;目录;miRNA的原理;miRNA如何行使功能？;miRNA途径： miRNA可以降解mRNA，或者抑制mRNA翻译蛋白质;RNAi作用机制;RNAi实验 三大基本路线;线路一：非哺乳动物细胞体系的RNAi实验和选择;（1）构建目的基因载体，选取目的基因的特异性序列（约200bp~300bp），构建到T载体上。 ?（2）使用5′端连接有T7启动子的引物PCR扩增目的基因，得到两端均连接有T7启动子 序列的目的基因片段。 （3）T7RNA聚合酶进行转录。dsRNA、ssRNA、DNA模板。 （4）加入Rnase 和Dnase消除ssRNA和DNA模板。 （5）离心纯化dsRNA。 ;2021/3/8;siRNA导入细胞的方法;线路二：哺乳动物细胞RNAi实验：siRNA的设计，合成;siRNA的转染;siRNA的转染;siRNA的转染;线路三：shRNA 表达载体和病毒载体; 此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和反义链的模板，正义与反义序列之间由一段环(1oop)序列隔开。插入载体Pol Ⅲ启动子下游，然后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠成具发夹结构的小RNA分子（shRNA） ，这些小RNA可被细胞内的Dicer切割为长21bp的siRNA。;2021/3/8; RNAi作为一种重要的基因转录后沉默机制，广泛应用于