PCR扩增产物的分析知识课件知识讲稿.pptVIP

酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切 酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究 分子杂交 检测PCR产物特异性的有力证据 检测PCR 产物碱基突变的有效方法 主要的杂交 Southern印迹杂交 斑点杂交 Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记（探针） 与 PCR 产物杂交 此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测 PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 斑点杂交： 将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上 寡核苷酸探针杂交 观察有无着色斑点 主要用于 PCR产物特异性鉴定及变异分析 RDB检测 ?-地中海贫血突变基因 -29（A?G） -28（ A?G） 17（ A?T，AAG ? TAG） βE （CD26 GAG ? AAG） IVS-I-1（ G?T ） IVS-I-5（ G?C） 27-28（+C） 41-42（-CTTT） 43（ G?T ） 71-72（+A或+T） 654（ C?T） 微孔板夹心杂交法 通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异性杂交，使PCR产物间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果 该法使用了两个杂交过程来检测一个产物，其特异性较一次杂交的检测法高 Principle ：NOS（1×1014/cm2） N-羟化琥珀酰亚胺酯 Principle --CCCCCC Capture Probe: ：NH2 Detection Probe: ：Biotin Principle 　　：NH2标记的探针 ：Biotin标记的探针 Avidin-HRP 显色系统 ：NOS基团 Principle 微孔板夹心杂交法 ——方法学评价 敏感度：该法检测HBV，敏感度达5个HBV DNA分子 敏感性和特异性与 PCR 32P 探针的Southern杂交法相当 PCR微孔板夹心杂交法：操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA 微孔板直接杂交 不是采用夹心法，而是直接将特异的探针固定于微孔板上，然后用生物素标记的PCR产物与之杂交 只进行一次杂交，方法简单，但特异性不高 PCR 扩增产物的分析 Gel electrophoresis Restriction endonuclease Molecular hybridization Nucleic acid sequence PCR扩增产物的电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 常用于临床检测（定性） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离效果比琼脂糖好，条带比较集中 可用于科研及检测分析 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等 电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解 10×TBE缓冲液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH应为8.0～8.2 临用时用水稀至0.5×TBE（20倍稀释） 核酸电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 琼脂糖凝胶浓度 0.6% 1% 1.4% 2% 迁移率 1Kb 0.6Kb 0.2Kb 0.15Kb 核酸电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当 琼脂糖凝胶浓度 1% 1.4% 迁移率 2Kb 1.6Kb 载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 ③使样品呈色，使加样操作更方便 核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂 溴化乙锭 银染色 核酸电泳的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子