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* * 比如，如果一抗是小鼠IgG来源的抗体，二抗需选择抗小鼠IgG的；如果一抗是小鼠IgM来源的抗体，则二抗要选择抗小鼠IgM的。 * * 专业生产底物的公司，在全球占有很大的市场。无论是化学发光还是显色的底物。具有很高的性价比 Western Blot 的具体步骤 转膜 转膜准备 第十四页，共四十三页。 制作“三明治” “黑胶白膜” Western Blot 的具体步骤 转膜 第十五页，共四十三页。 Western Blot 的具体步骤 转膜 转膜条件： 推荐：100V ，1——2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。 第十六页，共四十三页。 Western Blot 的具体步骤 转膜后检测：（立春红染色） 为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。 1x立春红 5min 染色前 染色后 第十七页，共四十三页。 五、封闭 脱脂奶粉（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液 ） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 不能用于磷酸化蛋白！ 第十八页，共四十三页。 六、一抗、二抗孵育 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与滤膜温育，室温小时或4℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温一小时或4℃过夜。 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 第十九页，共四十三页。 七、二抗与底物反应显色 ECL化学发光显色 比较常用，结果容易控制，但是被催化是 灵敏度差一点 DAB显色 比较灵敏，是HRP最敏感的底物 第二十页，共四十三页。 Western Blot 需要的主要试剂 第二十一页，共四十三页。 主要试剂 1. 1.0mol/L Tris?HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris?HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3. 10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 第二十二页，共四十三页。 4. 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5． 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4℃保存。 6． 30%丙稀酰胺： 4 ℃保存。 7． 5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8． 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。 （先加甲醇易产生沉淀） 第二十三页，共四十三页。 第二十四页，共四十三页。 9． 10XTBS缓冲液 Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸馏水至 1000ml （浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。 10．1XTBST缓冲液 10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900ml Tween-20 1 ml 因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。 溶解后室温保存。 11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)： 1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 5g 溶解后4℃保存，可于一周内使用。 第二十五页，共四十三页。 WB需要试剂－膜 常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜 第二十六页，共四十三页。 第二十七页，共四十三页。 主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。 WB需要试剂－蛋白质Marker