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一株新型饲料用酶菌株的筛选及发酵条件研究 植酸酶(phytase)也称肌醇六磷酸酶(myo - inositol- hexaphoshate phosphohydrotase)，它是催化植酸及其植酸 盐水解产生肌醇和磷酸（或者磷酸盐）一类酶的总称…，分 为两类，一是3 一植酸酶(EC 3.1.3.8)，二是6 一植酸酶(E C 3.1.2.6)，是一种新型、绿色环保的饲料用酶。由于动物 的消化道不能吸收植酸酶，大量未被利用的植酸磷排入环 境，造成水域的富营养化污染。植酸酶可释放植酸中的磷， 提高动物对磷的吸收利用率，减少排泄物中有机磷的含量。 目前，对酸性植酸酶研究较多，它仅适用于单胃动物畜禽和 少数鱼类 （如虹鳟等），但不适于消化道为中性的鲤科鱼类， 因此对中性植酸酶缺乏较深入的研究。鉴于此，我们从土壤 中筛选出产中性植酸酶的高产菌株，对其菌株的培养和分泌 中性植酸酶的条件进行了初步研究，为扩大中性植酸酶在饲 料工业中的应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 植酸酶菌株分离样品：样品为将采集于威海郊区玉米地 肥沃土壤中的植酸酶菌珠与麸皮、发芽小麦混匀并放置 20 余天后的混合物。 试剂：植酸钠p - 0109 （Sigma 公司），植酸钙（湖北 三鑫生物工程有限公司），其他试剂均为国产分析纯。细菌 营养肉汁平板培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaC15g /L、琼脂15--20 g/L,pH 7.0。 植酸钙筛选平板培养基：葡萄糖 20g/L、CaC122g/L、N HaN035g/L、KC10.5g/L、MgS047H200.05g/L、Fe-S047H20 0.01g/L、MnS04 H200．叭g/L、植酸钙lg/L、琼脂15g/L， pH 7.0。 产酶培养基：可溶性淀粉40g/L、胰蛋白胨10g/L、NAN 028.6g/L、NHaN035.0g/L、K2HP040.10g/L、KC10.10g/L、M gC120.10g/L、MnC120.09g/L, pH 7.0. 1.2 方法 产中性植酸酶菌株的筛选：将土壤样品稀释后均匀涂布 到筛选的培养基培养，3--4 后将产生透明圈的菌株接种于 营养肉汁平板培养基，划线分离；挑选单菌落接种于筛选的 培养基培养，3--4 后测量直径比 （直径比=透明圈直径／菌 落直径）；选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培 养基保存。 挑取上述初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30℃、 120--150r/min 摇振培养24h 后，按 10%接种量接种于 100m L 的产酶培养基，30℃、150r/min 摇振培养5 ，每24h 取5 mL 培养液，3000r/min 离心去菌体，上清液利用截留分子量 为I0000U 的透析袋在去离子水中透析3--4 ，得到去除无机 磷的酶液用于酶活性测定，根据酶活力大小对菌株进行复 筛。 培养条件对产酶的影响：分别采用不同的发酵温度、接 种量、培养基初始pH 和装液量，经培养后测定发酵液酶活， 找出最佳培养条件；更改培养基碳氮组成，以找出最佳碳氮 源。 酶活测定方法：采用硫酸亚铁一钼蓝法测定酶活l 6]。 酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出 1 nm ol 无机磷所需的酶量为一个酶活性单位，用U 表示，单位为 nmol/min。 2 结果与分析 2.1 菌株筛选土样经过筛选培养基涂布、富 集培养、多次划线分离、点种筛选，共初筛出 21 株植酸酶 产生菌。然后，再筛选出其中透明圈与菌落直径比值较大的 10 株（以phy 代表植酸酶菌株），在30℃、150r/min 振荡 下分别进行发酵培养 24 ，测定其发酵液酶活力大小。结果 见表l。由表1 可见，所筛选出的 10 个菌株的透明圈与菌落 直径比均在1.9--2.5 之间，得到酶活大于100IU/mL 的菌株 有2 株，即菌株phy7 和phylO。phyl0 经16SrDNA 序列测定 与分析，得到该菌属于假单胞菌属 (Pseudomonas)，且从系 统发育树得出该菌归属绿脓假单胞菌． 2.2 中性植酸酶产酶发酵条件 以phyl0 为实验菌株进行产酶条件研究。 培养基起始pH 对产酶的影响：配制不同起始pH 值(4.0 —9.0)的液体发酵培养基，30℃、150 r/min、10%的接种量 振荡培养24 h 后测定其发酵液酶活，结果