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Ultimate 3000 型高效液相色谱仪自主操作培训教材 福州大学测试中心2018 年 9 月 第一部分 Ultimate 3000 型高效液相色谱原理和仪器配置 一、液相色谱原理简介 1、色谱法起源 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 2、液相色谱法的分离原理 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相(stationary phase)时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。英文为 High Performance Liquid Chromatography，简称为 HPLC。 3、HPLC 分离模式 包括反相模式 (RP-LC)；正相模式 (NP-LC)；离子对色谱 (IPC)；离子交换色谱 (IEC)；体积排阻色谱 (GPC/GFC)；亲和色谱（AC）等。其中，反相和正相模式又属于液液分配色谱。 流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18 柱（常用反相柱）。 4、HPLC 与经典液相色谱方法以及气相色谱（GC）方法的比较 HPLC 与经典液相色谱方法比较 高速：HPLC 采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟； 而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 HPLC 与 GC 比较 分析对象及范围：GC 分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，占有机物总数的 20%；HPLC 可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的 80%。 流动相的选择：GC 采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC 采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，即流动相对分离的贡献很大， 可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC 需高温；HPLC 通常在室温下进行。5、HPLC 应用 由于 HPLC 分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。可应用于氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析。 二、HPLC 基本术语和色谱图 色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生 漂移。 色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯 Gauss 曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定 T 应为 0.95-1.05。T＜0.95 为前延峰，T＞1.05 为拖尾峰。 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相 HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间。 死