《生物技术实验》教学大纲（本科）.docxVIP

PAGE PAGE 68 生物技术实验 一、课程简介 生物技术实验是基础医学实验教学的重要组成部分，内容涵盖分子生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、医学免疫学等学科领域中常用的基本操作技术。 生物技术实验教学使生物技术专业学生认识染色体、核酸，同时学会基因扩增、蛋白质分离、抗原抗体特异性等技术原理和基本操作步骤。生物技术实验将培养学生科研工作的基本能力、加深学生对理论课内容的理解，提高学生实验动手能力和解决问题的能力。 二、实验教学内容 小鼠骨髓染色体制作及观察 基本内容：小鼠骨髓细胞有高度的分裂增殖能力，且数量非常多，因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞或组织那样要经过外培养。处于分裂期的细胞经秋水仙素处理，阻断纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，使细胞处于膨胀状态，滴片时细胞破裂染色体散开，可获得较好的骨髓细胞的染色体标本。小鼠染色体2n=40，均为端着丝粒染色体，雄性为40，XY，雌性为40， XX。 基本要求：掌握动物骨髓细胞染色体制备技术，学会动物细胞的滴片方法，了解正常人类染色体的形态、数目，小鼠骨髓细胞染色体与正常人类染色体形态、数目的差别。 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测 基本内容：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA聚合酶依赖于 DNA模板的特性，在体外模拟DNA的复制过程，经过变性、复性、延伸三个过程，在一对附加的引物之间诱发的聚合反应，短时间内可将要研究的目的DNA扩增数百万倍。 基本要求：掌握聚合酶链反应及琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法，学习PCR仪器的工作原理，了解基因多态性分析的方法及PCR技术的应用。 X染色质制备与观察 基本内容：正常女性的间期细胞核中紧贴核膜边缘有一个颜色染深的椭圆形小体，即巴氏小体也称为X染色质。通过提取口腔黏膜细胞作为原材料，经过固定、染色后进行观察。 基本要求：掌握X染色质形态特征，加深对剂量补偿效应的理解，熟悉X染色质标本的制作方法及lyon假说的内容。 酵母蔗糖酶米氏常数（Km）的测定 基本内容：蔗糖酶在pH5.0缓冲液中与不同浓度的蔗糖混合，恒温培养，经过规定时间生成一定数量的还原糖。还原糖在碱性溶液中与硫酸铜共热使二价铜（Cu2+）还原生成氧化亚铜，氧化亚铜再使磷钼酸还原成钼蓝，用分光光度法测定钼蓝，并进而判定还原糖的生成量，以此代表反应开始阶段的初速度（V）然后以不同底物浓度的倒数按林—贝氏作图法，从横轴上截距求出Km值。 基本要求：掌握蔗糖酶Km的测定方法，了解底物浓度对反应速度的影响及Km值的意义。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 基本内容：聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE，是在区带电泳原理的基础上，以凝胶孔径大小不同的两种浓度的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续性（即凝胶的不连续体性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两种胶体积聚浓缩成薄的起始区带（厚度1—2mm）即压缩效应，然后再进行电泳分离。 基本要求：掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。 血型测定和免疫妊娠胶体金间接凝集 基本内容：用胶体金标记技术，检测尿中有无HCG。首先将鼠抗人HCG的单克隆抗体（一抗）吸附在胶体金颗粒上（胶体金呈紫红色散在颗粒状，肉眼可见）并松弛地附着在A处。鼠抗人HCG（一抗）及兔抗鼠Ig（二抗）分别吸附在检测线B处及阳性对照线（C处）的硝酸纤维膜上。当尿液通过毛细作用上行时，尿中的HCG与A处的抗HCG胶体金结合，并且HCG—抗HCG—胶体金继续上行至检测线B处，并与B处的抗HCG发生反应，形成双抗体夹心免疫复合物，抗体 Fc段标有胶体金，即成清晰的紫红色。 基本要求：通过检测尿中有无HCG，掌握胶体金技术的原理。抗原与抗体特异性结合是免疫反应的实质，通过对凝集实验主要检测方法的了解，掌握血型检测及胶体金实验的原理与方法，了解血型测定和免疫妊娠检测在临床中的应用。 免疫荧光实验 基本内容：根据抗原抗体反应原理，将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，与相应的抗原或抗体起反应，从而使形成的抗原抗体复合物携带上一定量的荧光素，利用荧光显微镜可看出发出荧光的抗原抗体的结合物。免疫标记技术是抗原抗体反应与标记技术的结合，荧光是常用的免疫标记物之一，本实验主要是采用荧光标记第二抗体，检测自身免疫性疾病SLE病人的抗核抗体，对临床疾病诊断具有指导意义。 基本要求：掌握免疫荧光实验的基本原理及荧光显微镜的使用方法，了解各种抗体作为临床指标的意义。 单双扩散 基本内容：单双扩散是用一定浓度的琼脂制成凝胶后，其内部形成一种多孔的网状结构，可允许大分子