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第七章 亲和层析技术 第七章亲和层析技术 第二章亲和层析 1亲和分离技术概论 利用生物分子间的特异性、识别性或特异性相互作用的分离技术称为亲和分离技术。在该技术中，通过引入亲和配体实现亲和分离过程（如图2-1所示）。所谓亲和配体是指与生物分子具有特定识别或特定相互作用的物质。通过将亲和配体固定在不同的介质上，可以获得不同的亲和分离技术。例如，通过在色谱介质上固定亲和配体进行特定色谱分离的技术称为亲和色谱。将亲和配体连接到分离膜上，获得亲和膜分离技术。 图2-1：亲和分离过程的示意图 生物分子之间的亲和力识别包括抗体与抗原、酶与底物、激素与受体之间的亲和力，属于生物特异性识别；此外，某些物质与生物大分子之间还存在一些特殊的作用，如染料与某些酶（尤其是脱氢酶和激酶）、植物凝集素与糖蛋白、金属离子和组氨酸对蛋白质表面的作用，这些作用可用于亲和分离过程。 根据以上两种亲和作用的不同，可将亲和配基按其来源分为二类：生物特异性配基，如抗体、nad、amp等和拟生物亲和配基，如染料、金属离子等。 表2-1常用亲和层析的命名和作用原理及其相关应用名称免疫亲和层析固定化金属亲和层析染料亲和层析核苷酸亲和层析凝集素亲和层析抗体和抗原特异性识别Zn2+的作用原理，Ni2+和蛋白质表面基团特异性识别染料和蛋白质之间的特异性激酶蛋白质A（蛋白质A）亲和层析对IgG样抗体的特异性，如脱氢酶识别核苷酸和蛋白质之间的特异性激酶，脱氢酶识别凝集素和糖之间的特异性，糖蛋白反向结合免疫蛋白，亲和技术中使用的配体必须满足以下条件：（1）亲和配体与分离的生物大分子之间的特定识别或特定效应必须是可逆的。（2） 配体与分离的生物大分子之间的结合常数应足够高，以形成稳定的络合物；然而，同时，这种结合也不能太强。当外部条件适当改变且待分离的目标大分子未变性时，复合分子可被解离以将目标分子与配体分离，同时具有亲和力 配基得以再生。(3)能够进行一定的化学改性，易于固定在层析介质或其他分离介质上。且固定到分离介质上之后，配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。 目前，有很多亲和性分离技术和命名方法。一般来说，它通常是根据配体名称和所用技术名称的组合来命名的，如固定化金属离子亲和膜技术、染料亲和层析等。表2-1列出了常用亲和层析技术的名称、原理和简单应用： 1.1亲和配基 亲和配体在亲和分离技术中起着重要作用。亲和配体的特异性和专一性决定了在分离和纯化过程中获得的产物的纯度。亲和配体与目标分子之间的相互作用强度决定了吸附和脱附的难度，并影响其应用范围。 根据配基亲和作用专一性程度和配基分子量的大小，可以将它们做如下分类：(1)单专一性的小分子配基。如激素、维生素和某些酶抑制、金属离子等小分子，这些亲和配基只和某个或少数几个特定的蛋白作用，无论这些蛋白来源于特定细胞或生物体。单专一性的亲和配基专一性高，结合力较强，比较难于洗脱。 （2） 群体特异性小分子亲和配体。主要包括NAD及其类似物、惰性染料等酶辅因子。如果分离的酶需要辅因子，蛋白质可以与辅因子结合（如果配体是辅因子类似物，原理相同，但酶可以将其识别为辅因子）。通过使用辅助因子或类似物作为亲和配体，蛋白质可以与亲和配体结合，实现分离和纯化过程。 表2-2列出了一些基团专一性小分子亲和配基和它们对应能纯化的蛋白质。 表2-2小分子亲和配体和相应的分离产物配体5-atp2，5-adpnad+cibacronblue+蛋白质nad脱氢酶nad+依赖性脱氢酶nad+依赖性脱氢酶激酶或脱氢酶脱氢酶或干扰素和其他前阳离子HE-3b+，其中蓝色染料cibacronblue是nad辅因子的类似物，因此，它可以用来提取需要nad或NADP+的蛋白质酶。 (3)专一性的大分子亲和配基。利用生物大分子具有三维识别结构的亲和作用，将其中的一种作为配基，就可以用来分离另外所对应的生物大分子，如凝集素cona对多糖和糖蛋白有专一性；蛋白a及g对igg和igm等免疫蛋白有专一性。组织纤维溶酶原激活剂（t-pa）是一种糖蛋白，具有激活溶酶原，促进血纤维蛋白溶解的作用。该蛋白质可以用纤维蛋白作为亲和配基进行分离。表2-3给出了几种常见的亲和配基和对应的分离产品。 表3-2对应于产品亲和力组 英文名称heparinlectin中文名称肝素凝集素（如伴刀豆素a，大豆凝集素，麦胚凝集素等）蛋白质a.g如igg和igmproteina.g(4)免疫亲和配基。利用抗体和抗原之间的专一作用性进行的亲和分离技术，又称免疫吸附(immunosorbent)，在免疫吸附中使用的亲和配基称为免役亲和配基。该配基即可以是抗原，也