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实验九 甲醛滴定法测定氨基酸 一、目的 掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。二、原理 氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡： H N+—R—COO— ? H N—R—COO—+H+ 3 2 -NH ? 是弱酸，，完全解离时 pH 为 11～12 或更高，若用碱滴定-NH ? 所释放的 H+来测量氨基 3 3 酸，一般指示剂变色域小于 10，很难准确指示终点。 常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促 使-NH ? 释放 H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内(pH9.0 左右)。因此， 3 可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。 R-CH(COO—)-NH ? 3 ? R-CH(COO—)-NH +H+ ?N?aO?H ? 中和 2 R-CH(COO—)-NH ?H?C?HO ? R-CH(COO—)-NHCH OH ?H?C?HO ? R-CH(COO—)-N(CH OH) 2 2 2 2 如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量（ 脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定mL 数偏低。酪氨酸的滴定mL 数偏高）。如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速， 常用来测定蛋白质的水解程度。随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表 示水解作用已完全。 三、器材药 25 mL 锥形瓶；3 mL 微量滴定管；吸管； 0.1 mol／L 标准甘氨酸溶液 300 mL 准确称取 750 mg 甘氨酸，溶解后定容至 100 mL； 0.1 m01／L 标准氢氧化钠溶液 500 mL；（标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。） 酚酞指示剂 20 mL 0.5％酚酞的 50％乙醇溶液 中性甲醛溶液 400mL 在 50 mL 36～37％分析纯甲醛溶液中加入 1 mL 0.1％酚酞乙醇水溶液，用 0.1 mol／L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。 四、操作 取 3 个 25 mL 的锥形瓶，编号。向第 1、2 号瓶内各加入 2mL0.1 mo1／L 的标准甘氨酸溶液和 5 mL 水，混匀。向 3 号瓶内加入 7mL 水。然后向 3 个瓶中各加入 5 滴酚酞指示剂，混匀后各加 2 mL 甲醛溶液，再混匀，分别用 0.1 mo1／L 标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。 重复以上实验 2 次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL 数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。 甘氨酸氨基氮回收率％= 实际测得量 ×100 加入理论量 公式中实际测得量为滴定第 1 和 2 号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL 数的平均值与 3 号 瓶耗用的标准氢氧化钠溶液 mL 数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以 14.008。2mL 乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘 14.008。即为加入理论量的 mg 数。 取未知浓度的甘氨酸溶液 2 mL，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每 mL 甘氨酸溶液中含有氨基氮的 mg 数。 氨基氮(mg／mL)= ( A ? B) ? mol / LNaOH?14.008 2 式中：A 为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均 mL 数。 B 为滴定对照液(3 号瓶)耗用标准氢氧化钠溶液的平均 mL 数。mo1／L 为标准氢 NaOH 氧化钠溶液的真实摩尔浓度。思 考 题 选用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基? 注意事项 本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要求进行。