第十四章基因工程与蛋白质工程.pptVIP

粘性末端连接法 用同一种或两种限制酶去消化载体和外源DNA分子，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端能退火互补，进一步用DNA连接酶将断端封口，即可获得重组DNA分子。 用同一种限制酶处理外源DNA和载体，重组时可导致外源DNA特别是质粒的自我环化. 用碱性磷酸脂酶（不处理外源DNA分子）处理粘性末端的5‘磷酸基，能促使载体与外源DNA分子连接。重组体每条链仍残留的一个缺口，待进入宿主细胞内可被修复. 当前30页，共44页，星期日。 第三十页，共四十四页。 磷酸脂酶能防止载体的自我环化 当前31页，共44页，星期日。 第三十一页，共四十四页。 第十四章 基因工程与蛋白质工程 一、基因工程的定义及主要内容 二、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 三、克隆基因的表达 四、基因工程的成就和展望 五、蛋白质工程 当前1页，共44页，星期日。 第一页，共四十四页。 一、基因工程定义及主要内容 基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分子克隆. 是指利用DNA重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的微生物等. 是生物工程的重要内容之一. 当前2页，共44页，星期日。 第二页，共四十四页。 主要步骤： 1.带有目的基因的DNA片段的获得； 2、构建DNA重组分子； 3、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定； 4、基因的表达. 当前3页，共44页，星期日。 第三页，共四十四页。 基因工程基本程序 真核染色体DNA 克隆载体 （质粒） 限制酶切割 限制酶切割并 分离所需片断 重组载体 细菌宿主细胞的转化 细胞分离 培养增值 当前4页，共44页，星期日。 第四页，共四十四页。 构建DNA重组分子 工具酶 目的基因的制备 克隆载体 DNA分子的体外重组 当前5页，共44页，星期日。 第五页，共四十四页。 工具酶 限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶 DNA连接酶（DNA ligase）、DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymeraseⅠ）、末端转移酶（terminal transferase）、逆转录酶（reverse transcriptase）、核酸酶S1（nuclease S1）和核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ） 当前6页，共44页，星期日。 第六页，共四十四页。 限制性核酸内切酶 由Smith在1970年从流感噬血菌中发现. 细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身DNA的特异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源DNA相区别。这样，限制性核酸内切酶就能去切割破坏外源DNA，而对本身无影响。 目前已从原核生物中分离出400～500多种限制性核酸内切酶. 当前7页，共44页，星期日。 第七页，共四十四页。 限制性核酸内切酶 能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶 分类:三类. 命名: EcoRI 分布：主要来源于原核生物。 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）或平端。 举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 当前8页，共44页，星期日。 第八页，共四十四页。 限制性核酸内切酶 限制性内切酶可识别4或6个特异核苷酸序列. 粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识别序列的中心轴，在断段产生一个短的单股突伸出来的不齐末端。 钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别序列的中心轴处，即产生平齐末端。 当前9页，共44页，星期日。 第九页，共四十四页。 限制性核酸内切酶 同裂酶:来源不同,但有相同的识别序列.或称异源同工酶. 同切点酶:不仅识别序列相同,而且切点也相同. 同尾酶:酶的识别序列不完全相同,但切出的粘性末端相同. 当前10页，共44页，星期日。 第十页，共四十四页。 几种限制性内切酶的作用位点 当前11页，共44页，星期日。 第十一页，共四十四页。 几种限制性内切酶的作用位点 当前12页，共44页，星期日。 第十二页，共四十四页。 目的基因的制备 目的基因就是所需要克隆的外源基因. 制备方法： 1、人工合成法. 2、逆转录法. 3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中分离. 4、用PCR法扩增目的基因片段. 当前13页，共44页，星期日。 第十三页，共四十四页。 目的基因的制备：人工合成法 较小分子基因可用人工化学合成的方法获得. DNA化学人工合成的方法已经自动化. 人工合成目的基因的先决条件：基因的核苷酸序列是已知的. 缺点是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；3、费用较高 当前14页，共44页，星期日。 第十四页，共四十四页。 目的基因的制备：逆转