铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达.docVIP

铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达 文档信息 属性： Doc-03D0H8，doc格式，正文7207字。质优实惠，欢迎下载！ 说明： 作为医药学资料、临床医学资料的写作参考资料，提供解决怎么写及格式等相关问题。 适用： 作为文章写作的参考文献，解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容摘取等相关工作。 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达 2 1 材料和方法 2 2 结果与分析 4 3 讨论 5 文2：铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达 6 1 材料和方法 6 2 结果与分析 8 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达 文1：铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达 铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa )， 又称绿脓杆菌， 是临床感染性疾病中常见的条件致病菌之一。该菌致病机制复杂而多样， 其固有的对抗生素和消毒剂的耐受性使治疗十分困难。铜绿假单胞菌全基因组测序的完成[1]， 特别是近几年环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)对细菌生物学功能调控作用的突破性研究进展， 使得我们在分子水平上深入探讨其耐药机理， 在信号途径的研究中寻找新的作用靶点成为了可能。作为一种广泛存在于细菌中的新型的第二信使， c-di-GMP 参与调控了多种细菌生物学功能，如细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性及细菌的群体感应等[2]，但其作用机制尚不完全清楚。铜绿假单胞菌全基因组共有5，670个基因， 利用生物信息学手段，在其全基因组中发现了八种编码Pilz结构域(Pfam07238)蛋白基因。与胞外多糖海藻酸钠合成有关的Alg44 (PA3542) 蛋白已被实验证明为c-di-GMP的受体分子， 其余七种蛋白功能未知。为了鉴定这七种含Pilz结构域蛋白是否为c-di-GMP 潜在的受体分子， 我们对其基因进行了克隆并尝试构建它们的原核表达载体， 旨在为今后铜绿假单胞菌基因-表型-致病性的体外研究以及c-di-GMP信号通路的深入研究提供实验材料。 1 材料和方法 材料 铜绿假单胞菌PAO1、pET32a 载体以及原核表达宿主菌BL21(DE3)由本室保存;蛋白酶K购自德国Merck公司; 限制性内切酶BamH1和HindⅢ购自New England Biolabs公司;Pfu DNA聚合酶和T4 DNA 连接酶均购自Fermentas公司;IPTG为Sigma 公司产品。 铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA的制备 铜绿假单胞菌标准株PAO1在LB琼脂平板上划线纯化， 挑取单克隆， 接种于15mL LB培养基中， 37°C旋转培养过夜。3000g， 10 min离心收集细胞， TE()洗涤2次， 并重新悬浮于5 mL的TE缓冲液中， 加入250 μL 20%SDS溶液， 轻轻地颠倒几次裂解细胞。然后加入50μL的20 mg·mL-1蛋白酶K， 37°C作用1h。消化完成后， 加入等体积的Tris饱和酚， 轻轻混匀后于10000g离心10min， 取上清液。在同样的条件下用等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提后， 上清用2倍体积的异戊醇沉淀， 70%乙醇洗涤， 干燥后溶于100μL TE中， -20°C贮存备用。 引物设计 根据这七种含Pilz结构域蛋白的基因序列，分别设计合成了七对特异性扩增引物，其中5端引物含有BamH1酶切位点，3端引物含有HindⅢ酶切位点(表1)。表1 PCR引物序列注：F表示上游引物，R表示下游引物 目的基因的扩增 以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板， 分别用各自的特异性引物扩增出它们完整的基因。PCR反应体系为50 μL， 其中含1X PCR 缓冲液5 μL， 10mM的dNTPs 1 μL， 10 μM 的5 端引物和3 端引物各1 μL， ·μL-1的Pfu 聚合酶 1 μL， 模板DNA 100ng 。PCR 扩增条件为：94°C 预变性2 min;94°C 变性30s， 54°C 退火30s， 72°C延伸2 min， 共30 个循环;最后72°C 延伸5 min。反应结束后， 取5 μL PCR 扩增产物， % 琼脂糖凝胶电泳检测。 表达质粒的构建及表达 将上述PCR产物用%琼脂糖凝胶电泳回收。目的DNA片段及载体pET32a 分别用BamH1和HindⅢ 双酶切， 按8∶1的比例混合， 用T4 DNA连接酶16 °C连接过夜。将构建的pET32a-Pilz载体， 分别转化E. co