海洋生物技术：细胞培养.docVIP

PAGE 课程名称 海洋生物技术 教学内容 （项目) 实训五 细胞培养 授课进度 第九,十次授课 教学日期 及课节 第九,十周 共（4）学时 教学地点 实训室 教学目标 掌握细胞培养的方法 教学重点 掌握细胞传代培养的方法，微量移液枪与血球计数板的的使用 教学难点 细胞传代培养技术、细胞活力测定 学情 在蓝色经济与海洋+背景下，学生们对海洋生物技术很感兴趣。 教学设计 教学环节 时长 （分钟） 教学过程及内容设计 教学方法 学习任务一 45分钟 Ⅰ细胞传代 一 实验目的 熟练掌握细胞的传代培养法。 二 实验原理 传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。 三 实验材料 材料：培养瓶，试管，移液管，吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。 药品：培养基(MEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS液。 仪器：培养箱，显微镜，超净台。 四 实验步骤 1．人入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。 2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。 4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。 5．点燃酒精灯；取出无菌试管，吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。 6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7．倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2—3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8．每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。 9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7～10 mL／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回培养箱。 10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。 2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 五 实验作业 1．细胞传代培养的目的是什么? 2．如何保证在传代过程中不被微生物污染? 3．贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同? 4．如何估计是否传代和传代的方式? 演示法；讨论法；操作法 学习任务二 细胞活力测定 30分钟 Ⅱ细胞计数与死活鉴定 一 实验目的 利用显微镜并借助血细胞计数板，观察细胞形态并计数细胞浓度。 二．实验原理 三．实验材料 细胞液，血球计数板，盖玻片，计数器，显微镜 四．实验步骤 血细胞计数板 （1）用吸管混匀待计数的细胞悬液。（2）将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交界部位滴入 HYPERLINK /wiki/%E7%BB%86%E8%83%9E%E8%AE%A1%E6%95%B0%E6%B1%A0 细胞计数池中。（3）沉降1分钟，低倍镜下计数 HYPERLINK /wiki/%E8%A1%80%E7%90%83%E8%AE%A1%E6%95%B0%E6%9D%BF 血球计数板四大中格的结构完整的细胞，小细胞团计数为1。（4）计数时，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右。然后按下式计算出每 HYPERLINK /wiki/%E6%AF%AB%E5%8D%87 毫升悬液中的细胞数。（四大中格细胞数/4）*10000=细胞数/毫升 细胞活力测定步骤： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测