120301 医学分子生物学-1.ppt

哺乳动物细胞的RNA分布 rRNA的数量最多，占80％～85％（主要分为28S、18S、5.8S和5S四种）； 低分子量RNA如tRNA、snRNA等占15％～20％； mRNA仅占1％～5％; ⒊完整性鉴定 琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。 完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。 RNA电泳鉴定浓度和纯度 ～5 kb ～2 kb 0.1～0.3kb ?smear ～5 kb ～2 kb 0.1～0.3kb ?smear RNA电泳 核酸的保存 DNA的储存 DNA溶于TE缓冲液中在-70℃冰箱可保存数年。当TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低于7.0时DNA易变性。在DNA制品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与霉菌对核酸的污染。 RNA的储存 RNA溶于用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理过的水或三蒸水中，在-70℃保存，一般保存时间为一年。RNA沉淀置无水乙醇中可保留更长时间。 由于反复冻融产生的剪切力对核酸样品有断裂作用，在实际储存时，最好将核酸制品小量分装保存。 核酸的保存 第二节 真核细胞基因组DNA的分离纯化 染色体DNA 去除蛋白质、RNA ? 核酸和蛋白质的结构与功能及相互作用是分子水平生命活动的基础； ? 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根本原因。 生物大分子是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。 第一章 生物大分子的分离纯化 核酸（DNA，RNA）和蛋白质是生物体中最重要的生物大分子，是分子生物学研究和分子诊断的对象。 核酸和蛋白质的分离纯化是分子生物学 研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。 核酸的化学组成 核 酸 （RNA、DNA） 核苷 酸 磷酸 核苷 戊糖 碱基 核糖（RNA） 脱氧核糖（DNA） A、G、C、U A、G、C、T 碱基 腺嘌呤 鸟嘌呤 嘌 呤 嘧 啶 尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶 碱基 如果是存在于DNA中的脱氧核苷则2’位则是H而不是OH 核 苷 磷酸 + 戊糖 + 碱基 = 核苷酸 NTP，NDP，NMP dNTP，dNDP，dNMP 磷酸二酯键 DNA和RNA的一级结构 RNA序列 5’-pAAUUCGAUCGAAGGCGCCGGUU-3’ DNA序列 5’-pAATTCGATCGAAGGCGCCGGTT-3’ 3’- TTAAGCTAGCTTCCGCGGCCAAp-5’ 核苷酸链（一级结构） 3，5–磷 酸二酯键 3?末端 (游离羟基) 5?末端 (游离磷酸基) DNA的双螺旋结构 特征： ①两条链以反向平行的方式围绕同一中心轴向右盘绕 ②主链处于螺旋的外侧（核糖+磷酸） 亲水核糖平面与螺旋轴平行 碱基处于螺旋的内侧，与中轴垂直 ③螺距：10bp—3.4nm—3600 ?=2nm ④大沟与小沟： 蛋白质识别DNA的特定遗传信息的关键点 ⑤ 碱基互补配对A = T,C≡G 核酸变性 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 变性 复性 核酸的变性、复性 碱基配对 A＝T，C≡G 一级结构不变； 氢键； 碱基堆积力； 核酸的变性与复性 变性，解链温度或融解温度（melting temperature，Tm） 复性，淬火（quench）与退火（annealing） 50％的DNA变性 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 真核细胞基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 真核细胞RNA