CTAB法枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)基因组DNA的提取5373.docx

. CTAB法枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）基因组DNA的提取 内容提要 以枯草芽孢杆菌为材料，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）提取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的基因组DNA作为基因扩增的模板，并测定其含量和纯度。 本实验要求：提取高质量的基因组DNA为下一步的基因操作准备。 原理 高纯度、高分子量的基因组DNA是建立基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR等后 续的分子生物学操作的基础。利用基因组DNA较长的特性，能够将其与细胞器或质粒等小分子 DNA分别。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即积淀形成纤维状絮团飘浮其 中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状积淀附于壁上及底部，进而达到提取的 目的。在提取过程中，染色领会发活力械断裂，产生大小不同的片段，因此分别基因组DNA时 应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证获得较长的 DNA。一般来说，建立基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带 合适尾端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR剖析,DNA长度可短至50kb，在该长度以上， 可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的 不同组织因其细胞构造及所含的成分不同，分别方法也有差别。在提取某种特殊组织的DNA时 必须参照文件和经验成立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和 酶类物质对随后的酶切、PCR反响等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因 组DNA时,应考虑除掉多糖和酚类物质。 可编写 . DNA的含量与纯度在研究工作中十分重要，经常需要测定。当前使用较多和较简易的是紫外吸 收法。核酸在260nm波长有一特点吸收峰，根据其光密度（OD）值可计算DNA浓度。蛋白 质在260nm波长处有一特点吸收峰，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，因此 当核酸样品中蛋白质含量较低时，对核酸的紫外测定影响不大。DNA的260nm与280nm吸 收比值在1.8左右，当制品中蛋白质含量较高时此比值下降，比值大于2时表示RNA及核酸碎 片多，比值在表示纯度较好。 一、主要仪器、材料、和试剂 1.仪器 移液器，高速冷冻离心计，台式离心计，水浴锅，紫外可见分光光度计。 2.实验材料 枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis） 3.试剂 ⑴.CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O，迟缓加入10gCTAB，加水至100ml。 ⑵.氯仿：异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%乙醇，TE（10mMTris-HCl， 1mMEDTA,pH8.0），10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，5mol/LNaCl。 二、操作步骤 1.取100ml留宿培养的菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清液。 可编写 . 2.菌体积淀用10mlTE悬浮，并加0.5ml10%SDS，50μ蛋l白酶K，混匀，37℃保温1小 时。 3.加1.5ml5mol/LNaCl，混匀。再加1.5mlCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。 4.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm离心10分钟，移取上清液至洁净离心 管。 5.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至洁净管中。 6.加1倍体积异丙醇，颠倒混淆，室温下静止10分钟，10000rpm离心15分钟获得DNA沉 淀。 7.加入700μl70%乙醇，70μl3MNa漂A洗cDNA积淀，溶解于1mlTE，-20℃保留。 8.去除RNA：加5μlRNase加1/10体积3MNaAc加2倍体积无水乙醇10分钟后，将DNA 积淀溶于1mlTE，-20℃保留。 9.用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 10．用分光计测定浓度及纯度：产品DNA溶液用TE缓冲液适合稀释后以TE调零，在260nm 和280nm处分别测光密度OD值，计算DNA浓度（经验公式ug/ml=OD260×50×稀释倍数） 以及含量、产率计算OD260/OD280比值，评论其纯度。 可编写