酶的分离纯化 (2).pptVIP

（四）电泳 电泳是指在电场的作用下，这些带电颗粒向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 第61页，共110页，编辑于2022年，星期四 第62页，共110页，编辑于2022年，星期四 琼脂糖凝胶电泳 第63页，共110页，编辑于2022年，星期四 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第64页，共110页，编辑于2022年，星期四 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。 第65页，共110页，编辑于2022年，星期四 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE） SDS(十二烷基磺酸钠)--阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，使蛋白质舒展。并且每2个氨基酸与一个SDS结合，使得每个蛋白质分子所带电荷基本相同。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异，电泳迁移率只与蛋白质分子量大小有关 第66页，共110页，编辑于2022年，星期四 第67页，共110页，编辑于2022年，星期四 第68页，共110页，编辑于2022年，星期四 制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。 第69页，共110页，编辑于2022年，星期四 有几个方法可以鉴定蛋白质的位置： (1) Coomassie Blue 染色法; (2) 活性染色; (3) UV 照射呈像。定位后要把含有目标酶的凝胶切出來，进行电泳分离，获得酶 第70页，共110页，编辑于2022年，星期四 （五）离心 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 第71页，共110页，编辑于2022年，星期四 第72页，共110页，编辑于2022年，星期四 密度梯度区带离心法（简称区带离心法） 第73页，共110页，编辑于2022年，星期四 差速离心法 第74页，共110页，编辑于2022年，星期四 （六）层析 层析法又称色谱法（Chromatography），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 第75页，共110页，编辑于2022年，星期四 第76页，共110页，编辑于2022年，星期四 层析分离方法 层析方法 分离依据 吸附层析 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 第77页，共110页，编辑于2022年，星期四 离子交换层析 第78页，共110页，编辑于2022年，星期四 第79页，共110页，编辑于2022年，星期四 （4） 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。 第29页，共110页，编辑于2022年，星期四 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液 PH2～6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 碱溶液 PH8～12的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 有机溶剂 可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 第30页，共110页，编辑于2022年，星期四 二、酶分离纯化的基