实验技术专题写作指导pcr.pptx

PCR技术及其应用;目 录; 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction);体内DNA的复制体系;Mullis的PCR构思;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);PCR反应循环;;;1）PCR反应成分;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;PCR技术的特点;2）特异性;引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。;3）操作简便易行;ＲＴ－ＰＣＲ; 实时荧光定量PCR仪;PCR示例;1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2;1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL;2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL;3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。;The End！