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第十二章、核酸通论 章核酸的理化性质研究方法详解演示文稿 第一页，共二十三页。 （优选）章核酸的理化性质研究方法 第二页，共二十三页。 核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质： 核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解； 磷酸基和碱基：酸碱性质； 碱基：紫外吸收特性； 双螺旋结构：变性和复性。 第三页，共二十三页。 一、核酸的水解 （一）酸水解 糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱 （二）碱水解 RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸） 第四页，共二十三页。 （三）酶水解 专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。 能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。 第五页，共二十三页。 1、核酸酶的分类 （1）按底物专一性分类： 核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸； 脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）：作用于脱氧核糖核酸； （2）按底物作用的方式分类： 核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶； 核酸内切酶(exonuclease)：从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。 第六页，共二十三页。 （3）按磷酸二酯键断裂的方式分类： 一种是在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）； 另一种是在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。 P P P N N N (1) (2) (1) (2) 5’ 3’ 第七页，共二十三页。 2、核糖核酸酶类 牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等； 3、脱氧核糖核酸酶类 牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。 4、N－糖苷酶 第八页，共二十三页。 核酸酶 底物 切点 产物 胰核糖核酸酶 RNA 内切核酸酶嘧啶3’端，留下3’－P 3’嘧啶单核苷酸或3’-嘧啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸 蛇毒磷酸二酯酶 RNA，DNA 外切核酸酶3’端，留下3’－OH 5’－单核苷酸 牛脾磷酸二酯酶 RNA，DNA 外切核酸酶5’端，留下5’－OH 3’－单核苷酸 大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ 单链DNA 外切核酸酶5’端，留下5’－OH 3’－单核苷酸及一个末尾二核苷酸 大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ 双链DNA 外切核酸酶3’端，留下3’－OH 5’－单核苷酸 第九页，共二十三页。 第十页，共二十三页。 二、核酸的酸碱性质 1、碱基的解离 C的N3有一对未共用电子，可与质子结合； C的烯醇式羟基具有释放质子的能力； U的N3酸性解离的pK1’=9.5; T的N3酸性解离的pK1’=9.9; A的N1pK1’=4.15 G的N7 pK1’=3.2 N1pK2’=9.6； N9 pK3’=12.4 第十一页，共二十三页。 2、核苷的解离 戊糖的存在增强了碱基的酸性解离： A的N1pK1’由4.15降为3.63； C的pK1’由4.6降为4.15； 第十二页，共二十三页。 3、核苷酸的解离 H pK1’＝1.5 第十三页，共二十三页。 核苷酸有磷酸与碱基，为两性电介质； U的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子； A,G,C中， pK1’：第一磷酸基-PO3H2的解离； pK2’：含氮环＝N+H-的解离； pK3’：第二磷酸基-PO3H-的解离； 故其pI＝（ pK1’ + pK2’ ）／2 DNA变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。 第十四页，共二十三页。 三、核酸的紫外吸收 Py和Pu有共轭双键，使 碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm。不同核苷酸 第十五页，共二十三页。 A260＝εCL 公式中， A260为光密度 　　　　　ε，为260nm处的碱苦摩尔消光系数 　　　　　C，为每升溶液中碱基的摩尔数 　　　　　L，为比色杯内径的厚度 如：已知鸟嘌呤溶液的A260＝0.325， 　　　　　　　　　　ε＝7.2X103，L＝1cm， 则：C＝0.325/(7.2X103X1)＝4.5X10-5（mol/l） 紫外光区最大吸收：260nm，定性定量分析 第十六页，共二十三页。 第五节 DNA的理化性质及其应用 一、核酸的一般理化性质 核酸具有酸性； 粘度大； 第十七页，共二十三页。 第十二章、核酸通论