舟山眼镜蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化理化及酶学性质.docVIP

舟山眼镜蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化理化及酶学性质 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：舟山眼镜蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化理化及酶学性质 1 1材料和方法 2 文2：舟山眼镜蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化理化及酶学性质医学论文 6 1材料和方法 6 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 舟山眼镜蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化理化及酶学性质 文1：舟山眼镜蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化理化及酶学性质 蛇毒成分复杂，主要为酶和毒素，L氨基酸氧化酶(.)在蛇毒中分布非常广泛，在蝰科、响尾蛇科、眼镜蛇科以及蝮蛇科中都有分布[14]。L氨基酸氧化酶(Lamino acid oxidase，LAO)是蛇毒中一种重要的活性组分，能够催化L氨基酸的氧化脱氨反应，生成相应的α酮酸、氨以及过氧化氢[5]，具有多种生物活性，如诱导血管内皮细胞凋亡、抑制或诱导血小板聚集、细胞毒性和抗菌活性等[610]。已从几种蛇毒中分离得到LAO，笔者应用凝胶色谱和离子交换色谱从舟山眼镜蛇蛇毒分离LAO，并对其部分理化和酶学性质进行初步研究。 1材料和方法 材料 蛇(Naja atra)蛇毒冻干粉，福建医科大学蛇毒研究所提供。 试剂与仪器L苯丙氨酸(批号040924，上海翔军生物科技有限公司);砷酸钠（Lot#:0892B82，美国Amresco公司）;过氧化氢酶（AA1041，美国Sigma公司）。SephadexG100凝胶柱(瑞典Ameham Pharmacia Biotech公司);CM20阳离子交换填料预装柱(POROS 20，美国Applied Biosystems公司);BioCAD纯化工作站(美国Applied Biosystems公司);自动部分收集器(BSZ100)和恒流泵(HL1，上海沪西分析仪器厂);恒温摇床(美国Forma公司);紫外分光光度计(美国Biorad公司);试剂均为进口或国产分析纯。 方法 凝胶色谱Sephadex G100凝胶柱( cm×100 cm)用HAcNaAc缓冲液(pH ， mol/L+NaCl mol/L)预先平衡过夜。称取眼镜蛇粗毒 g溶于10 mL双蒸水，4 ℃静置过夜，4 ℃ 10 000 min离心10 min。取上清液凝胶柱，用HAcNaAc缓冲液洗脱，流速16 mL/h。收集洗脱液，4 mL/管，根据D(280 nm)值绘出洗脱曲线。 分LAO活力按文献[5]介绍的流程和反应体系进行分离组分酶活力测定。凝胶色谱洗脱组分 mL与L苯丙氨酸反应，以终产物的光密度值[D(300 nm)]为指标，以反应体系中加HAcNaAc缓冲液 mL取代蛇毒组分为未加酶对照。一个活力单位定义为在上述条件下得到 nm所需的酶量。 经凝胶色谱收集的具有LAO活性的组分。以POROS 20进行纯化。线性梯度洗脱(A液: mol/L，pH 的HAcNaAc缓冲液;B液:含有 mol/L NaCl的平衡液)，收集洗脱蛋白峰，浓缩和脱盐。测定POROS 20离子交换层析各组分的LAO活性，收集具有活性的组分，用POROS 20离子交换层析，以 mol/L，pH 的HAcNaAc缓冲液平衡，线性梯度洗脱(A液: mol/L，pH 的HAcNaAc缓冲液;B液:含有 mol/L NaCl的平衡液)，进一步纯化，收集活力峰，浓缩、透析脱盐。 鉴定及相对分子质量按碱性不连续系统进行。样品按是否含有2%β巯基乙醇分为还原性和非还原性两种。在Hoefer电泳仪上电泳2 h，稳流12 mA/10 cm×10 cm。常规染色脱色。在Image Master VDS凝胶成像系统上依据标准蛋白绘制标定曲线，计算相对分子质量。 [11]方法，将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260 nm和280 nm处分别测出D值，然后利用280 nm和260 nm波长下的吸收差求出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度(mg/mL)=(280 nm)-(260 nm) 对温度和pH适应性最适pH测定:在pH ~缓冲液中，其他条件不变，测定酶活力。最适温度测定:酶液在 moL/L，pH 的TrisHCl缓冲液中，测定20，30，40，50，60和70 ℃下的酶活力。以酶活力最高者为100%，其余折算为最高活力的百分数，并以pH或温度为横坐标，最高活力百分数为纵坐标，绘制酶活力适应曲线。 (Km)酶液与不同浓度L苯丙氨酸反应，利用反应终止法测定酶反应初速度(V)，根据LineweaverBurk作图法求出该酶对L苯丙氨酸的Km值[12] 2结果 眼镜蛇蛇毒凝胶色谱眼镜蛇毒粗毒经Sephadex G100