基因工程药物分离纯化.ppt

B 离子交换层析 10 外源基因表达产物的分离纯化 离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换层析的基本操作 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。 离子交换介质的基本性质 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物 如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳 离子交换剂的基本性能 离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗 脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去 电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的 离子交换介质的基本性质 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型 可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 离子交换剂的分类 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH） 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离的基团 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ） 离子交换介质的基本性质 离子交换剂的分类 强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小 弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱 弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱 离子交换介质的基本性质 常用的离子交换剂 离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化 离子交换介质的基本性质 常用的离子交换剂 离子交换纤维素： 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大 阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等 维素） 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 离子交换介质的基本性质 常用的离子交换剂 离子交换葡聚糖： 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下： 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质 离子交换介质的基本性质 常用的离子交换剂 离子交换葡聚糖： 常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25，Sephadex C-50 阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 离子交换介质的基本性质 常用的离子交换剂 离子交换琼脂糖： 离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型） 尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因 的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点 此具有稳定的外形体积 离子交换介质的选择原则 一般而言： 酸性物质用阴离子交换剂分离 氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化 碱性物质用阳离子交换剂分离 曲线来选择 离子交换介质的选择原则 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 pH + - 蛋 白 质 净 电 荷 等电点 吸附阴离子交换剂 吸附阳离子交换剂 pH pI（+） pH = pI（0） pH pI（-） 对pI=5的某酸性蛋白质 在pH5