小鼠抑郁样行为与尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变的关系研究.docVIP

小鼠抑郁样行为与尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变的关系研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：小鼠抑郁样行为与尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变的关系研究 2 1．材料 3 2．方法 3 1．行为学观察结果 5 2．脑组织超微结构变化 5 3．免疫组织化学染色结果 5 4．免疫印迹法检测结果 6 文2：百草枯致小鼠神经行为改变的实验研究 8 1 对象与方法 9 2 结果 10 3 讨论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 小鼠抑郁样行为与尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变的关系研究 文1：小鼠抑郁样行为与尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变的关系研究 星形胶质细胞是神经系统中数量最多的细胞，对神经元起支持、营养、代谢、保护等作用。且越来越多的证据表明，星形胶质细胞参与了神经兴奋性传递和突触可塑性等重要的生理过程，其结构的异常或功能的改变与包括抑郁在内的多种神经、精神疾病的发病密切相关[1，2，3，4]。近年来对星形胶质细胞在抑郁发病机制的研究显示，大量表达于星形胶质细胞膜上的水通道蛋4(aquaporin4，AQP4)基因突变或蛋白表达异常与抑郁发病密切相关;AQP4缺失通过引起脑部类淋巴系统功能障碍，海马神经元发生下降和脑源性神经营养因子减少等途径，参与神经递质释放，神经发生和突触可塑性调节，成为目前抑郁症机制研究的热点之一[5，6，7，8，9，10]。本课题组前期工作显示，尿素通道蛋白B(UT-B)基因敲除小鼠具有抑郁样行为，但具体机制不明[11]。UT-B是一种特异性介导尿素分子快速跨膜转运的膜蛋白[12]，其在体内广泛分布于红细胞、肾脏等部位，在神经系统中UT-B和AQP4均表达于星形胶质细胞膜;两者功能具有相似性，均可调节水分子跨膜转运，维持脑组织渗透压。UT-B基因敲除是否对AQP4的表达和功能产生影响，以及这一改变与UT-B基因敲除小鼠抑郁行为之间的相关性值得探讨。为此，本研究通过糖水偏好和强迫游泳实验，观察野生型和UT-B基因敲除小鼠的行为表现，采用电子显微镜比较两组小鼠脑组织超微结构差异，免疫组织化学和免疫印迹技术分别检测AQP4的表达特征和水平，探讨UT-B敲除对小鼠脑组织AQP4表达的影响，为深入研究UT-B蛋白在抑郁症病理机制中的作用提供实验依据。 材料和方法 1．材料 8～12周龄重量匹配、雌雄不拘的野生型和UT-B基因敲除小鼠各10只(遗传背景为C57)，由北京大学杨宝学教授馈赠，动物合格证号:SCXK(渝)2018-0003。 2．方法 行为学检测:糖水偏好实验(SPT)反映抑郁症状中快感的缺失，快感缺失是指对奖励刺激缺乏兴趣，为抑郁症的核心症状之一[13]。糖水偏好测试之前对实验小鼠禁食禁水24h，之后进行12h糖水偏好测试。实验期间，每只小鼠预先称重1瓶1%糖水(w/v)和1瓶白水;6h后交换瓶子位置，以排除小鼠对饮水的位置(左/右)偏好;待实验结束，称重2瓶水的重量，计算小鼠的糖水偏好。糖水偏好指数(%)=糖耗水量/(糖耗水量+纯水消耗量)×100% 强迫游泳实验(FST)是测试评价啮齿类动物抑郁绝望行为的经典实验[14]。将小鼠垂直放入水中，小鼠会自主地挣扎并积极逃亡，如跳跃、游泳或潜水，但随着测试时间延长，小鼠会不动漂浮于水面，这种不动即被认为是绝望和抑郁的表现，不动时间越长，表明抑郁越严重。实验装置:直径14cm，高20cm的有机玻璃缸，向内注入温度为(25±1)℃的自来水至水深(10±1)cm。本实验共进行6min，记录后4min小鼠的不动时间(绝望时间)。实验结束后将小鼠于30℃条件下烘干并放回笼，须更换缸内的水，避免对后续实验小鼠产生警示信号而影响其行为。 透射电子显微镜技术:采用3%戊巴比妥钠(85mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，先后以生理盐水和4%戊二醛经左心室灌注。取小鼠前内侧额叶皮质切成1cm3小块，采用%戊二醛和1%锇酸固定，缓冲液漂洗后，乙醇及丙酮脱水。电子显微镜环氧树脂组织包埋试剂盒包埋，切片，修片，超微切片及染色后，透射电子显微镜观察。 免疫组织化学检测AQP4蛋白的表达变化:野生型和AQP4基因敲除小鼠各3只，按上述方法麻醉后采用左心室生理盐水冲洗及4%多聚甲醛灌注固定后断头，取完整大脑入4%多聚甲醛后固定24h，20%蔗糖脱水后常规石蜡包埋做连续冠状切片，片厚6μm。石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化后，采用/L枸橼酸盐缓冲液()修复抗原，山羊血清工作液以封闭非特异性结合位点，37℃30min;滴加兔AQP4多克隆抗体(Milli