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建立和鉴定CLCN2基因突变患者尿液来源特异诱导多能干细胞及其神经分化能力研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 2 文1：建立和鉴定CLCN2基因突变患者尿液来源特异诱导多能干细胞及其神经分化能力研究 2 一、标本来源 2 二、细胞、质粒和主要试剂 3 1.细胞和质粒 3 2.主要培养基配方 3 3.其它主要试剂 3 三、方法 4 1.尿液细胞的收集、扩增培养 4 2.尿液细胞的重编程 4 4.核型鉴定 5 5.基因突变分析 6 6.免疫荧光染色 6 9.体内畸胎瘤形成实验 7 一、CLCN2患者尿液细胞重编程为iPSC 7 三、CC2L-i PSC包含纯合的CLCN2突变 8 四、CC2L-iPSC能够向神经方向分化，形成星形胶质细胞 8 文2：建立和学生的空间观念 12 【案例1】 观察物体 12 【案例2】 观察物体 13 1.先让学生辨认20174 13 1.探究平形四边形的面积计算公式 14 （4）推导平行四边形的面积计算公式 15 2.应用平行四边形的面积公式计算平行四边形的面积 15 参考文摘引言： 15 原创性声明（模板） 17 文章致谢（模板） 17 正文 建立和鉴定CLCN2基因突变患者尿液来源特异诱导多能干细胞及其神经分化能力研究 文1：建立和鉴定CLCN2基因突变患者尿液来源特异诱导多能干细胞及其神经分化能力研究 CLCN2基因是编码氯离子通道2(ClC-2）蛋白的基因。ClC-2在人体中分布广泛，尤其在大脑中表达较高，其在调节水电解质平衡中发挥重要作用。CLCN2相关白质脑病（CC2L）是由CLCN2基因突变进而导致ClC-2功能障碍而引起的常染色体隐性遗传病。CC2L患者常表现为视网膜脉络膜病变或视神经萎缩、男性不育、小脑性共济失调、认知障碍、学习障碍等，颅脑MRI常提示髓鞘空泡变性[1]。关于CC2L，仅有少量的病例报道，且由于尚无合适的疾病模型，其致病机制尚不明确，目前也无有效的治疗手段。因此，创建用于研究CLCN2基因相关疾病的体外细胞模型很有必要。 随着体细胞重编程技术的发展，获取患者特异的诱导多能干细胞（iPSC）成为现实[2]。研究表明，iPSC具有向机体几乎所有细胞分化的能力，不仅可构建多种体外细胞模型进行疾病机制的研究以及药物筛查，还可用于替代移植治疗[3，4]。本课题组旨在建立CLCN2突变患者特异iPSC系（CC2L-iPSC），为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗提供研究基础。 材料与方法 一、标本来源 采集1例就诊于中山大学附属第三医院神经内科的38岁女性患者的尿液。该例患者表现为双手的意向性震颤、记忆减退、耳鸣及视力减退；体格检查提示小脑性共济失调；大脑MRI提示内囊、大脑脚和小脑中脚的白质出现异常的T1加权像低信号、T2加权像高信号，随后的Sanger测序证实其CLCN2基因有1个纯合致病突变（Exon20:T;），其符合CC2L的诊断标准[5]。本实验征得患者同意并签署知情同意书，而且经中山大学附属第三医院伦理委员会批准。 二、细胞、质粒和主要试剂 1.细胞和质粒 正常人IPSC系UE017及质粒pCEP4-miR-302-367 cluster均由中国科学院广州生物医药与健康研究院潘光锦研究组馈赠；pEP4-EO2S-ET2K购自美国Addgene。 2.主要培养基配方 尿液细胞培养液——由DMEM/Ham’s:F12 1:1(Life Technologies）、10%胎牛血清（Gibco）、/L非必需氨基酸（Gibco）、1 mmol/LGluta MaxTM-1(Gibco）、 mmol/Lβ-Mercaptoethanol(Gibco）和 mmol/L Renal Cell Growth Medium(Lonza）、 mmol/LSingle Quotkit supplements(Lonza）、 mmol/L penicillitreptomycin(Gibco）配成；神经诱导培养基（Gibco）；增殖培养基——由NeurobasalMedium(Gibco）、Advanced DMEM/F-12(Gibco）和Neural Inductioupplement(Gibco）按49∶49∶2配成；星形胶质细胞分化培养基——由DMEM(Gibco）、1x N2和1%胎牛血清（Natocor）配成。 3.其它主要试剂 L-gelatin基质胶（Millipore);EDTA-胰蛋白酶（trypsin-EDTA，Gibco);NucleofectorTMKit for