金黄色葡萄球菌生物被膜形成受利福昔明和精油抑制作用的影响研究（畜牧与动物医学资料）.docVIP

金黄色葡萄球菌生物被膜形成受利福昔明和精油抑制作用的影响研究（畜牧与动物医学资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：金黄色葡萄球菌生物被膜形成受利福昔明和精油抑制作用的影响研究 1 1、材料与方法 2 2、结果与分析 6 3、讨论 7 文2：细菌生物被膜形成中信号分子的作用分析 9 1、密度感应系统 (QS) 相关信号分子 10 2、环二鸟苷酸 (c-di-GMP) 13 4、展望 18 参考文摘引言： 19 原创性声明（模板） 19 文章致谢（模板） 20 正文 金黄色葡萄球菌生物被膜形成受利福昔明和精油抑制作用的影响研究（畜牧与动物医学资料） 文1：金黄色葡萄球菌生物被膜形成受利福昔明和精油抑制作用的影响研究 奶牛乳房炎是乳业生产中最常见的疾病之一，会致牛奶产量和品质下降，造成巨大的经济损失[1]。细菌感染是主要病因之一，其中约30%的乳房炎与金黄色葡萄球菌(金葡菌)感染有关[2]。防治以乳房注入抗菌药物为主。其中干奶期预防，每乳区注入1～2次，维持整个干奶期(60～65d);泌乳期治疗，疗程往往3～6d或更长，弃奶期常需4～9d，仍难以有效清除病原菌[3]。有研究显示金葡菌能够形成生物被膜，可逃逸抗菌药物的抑杀[1] 金葡菌生物被膜是由金葡菌和其产生的胞外基质形成的复杂结构，胞外基质包括多糖细胞间黏附素(polysaccharideintracellularadhesin，PIA)、细胞外DNA(extracellularDNA，eDNA)和蛋白质，可黏附于生物和非生物表面，一方面保护细菌免受抗生素杀灭，产生耐药性，另一方面又相当于“细菌库”长期不断释放细菌，致感染迁延为慢性[1]。有研究表明，亚抑菌浓度抗菌药物与细菌长期接触，能够促进或抑制生物被膜形成，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等[4]。利福昔明属于利福霉素类抗生素，抗菌谱广，抗菌作用强，已批准于干奶期应用防治奶牛乳房炎[5]。利福昔明乳房注入后，长期存留于乳区中，存在以亚抑菌浓度与细菌长期接触的可能，是否对病原菌生物被膜的形成有促进或抑制作用，尚未见报道，值得研究。 植物精油是由植物的挥发性次代谢物和芳香物质等组成的多组分天然混合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、或免疫调节等多种生物活性[6]。Hemaiswarya等[7]发现植物精油与氨苄西林、红霉素、诺氟沙星等多种抗菌药物有协同杀菌作用。食品工业与医药临床均发现精油有阻抑细菌生物被膜形成的作用[8，9]。因此，本试验测定了利福昔明与精油单独、联合对金葡菌的抑菌活性，并初步研究了两者单独和联合对强成膜菌株生物被膜形成的作用。 1、材料与方法 材料 利福昔明对照品，购自中国食品药品检定研究院，批号为130542-200601;3种精油:薄荷油、桉叶油和鱼腥草油，购自吉水华源香精有限公司;水解酪蛋白(MH)肉汤培养基，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，琼脂糖购自青岛高科园海博生物技术有限公司;结晶紫、甲醇、冰醋酸、PBS、葡萄糖等试剂均为分析纯。 菌株 金葡菌ATCC29213;9株金葡菌临床分离株，由南京农业大学兽医药理学和毒理学实验室从乳房炎患牛乳汁中分离、鉴定并保存。 药品贮备液的制备 利福昔明溶液的配制:精密称取利福昔明适量，用甲醇溶解，配成25mL浓度为1280μg·mL-1的药液，过滤分装，保存于-20℃冰箱。 精油溶液的配制:精油、乙醇和吐温-80以体积比例2∶1∶1配比溶解，配置得到50%的精油溶液，过滤分装，常温保存。 菌液制备 将冻存的菌株接种于5mLTSB培养基复苏后，接种划线于胰蛋白胨大豆固体(TSA)培养基，置37℃过夜培养;挑取平板上的单菌落接种于3mLTSB培养基中，置37℃摇床震荡孵育10～12h，用MH肉汤稀释菌液使其OD595nm约为，即菌液浓度为1×108CFU/mL，再用MH肉汤或TSB-g培养基(添加1%葡萄糖的TSB)倍比稀释菌液至得所需浓度。 利福昔明和精油对金葡菌最低抑菌浓度(MIC)的测定 用MH肉汤将药液稀释至所需浓度，加200μL至第1列，无菌96孔板第2～11列加入MH肉汤100μL，逐次倍比稀释得系列梯度浓度药液;将菌液用MH肉汤稀释100倍，第1～11列加入稀释完成的菌液100μL;第12列前4孔每孔加入200μLMH肉汤为阴性对照，后4孔每孔加入200μL菌液为阳性对照。每个菌设置2个平行。培养板置于37℃培养18～22h，观察结果。阴性对照孔无菌生长，阳性对照孔生长良好，试验有效;试验孔中细菌生长程度与阳性对照孔进行对比，能够明显抑制细菌生长的最小药物浓度定为MIC。试验重复3次。 利福昔明和精油联合的药敏试验 将利福昔明和精油用MH