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分析肌肽对动物糖代谢（医药卫生资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：分析肌肽对动物糖代谢 1 1材料与方法 2 文2：丹参川芎联合骨瓜或骨肽对糖尿病骨质疏松患者糖代谢和骨代谢的影响 6 参考文摘引言： 7 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 10 正文 分析肌肽对动物糖代谢（医药卫生资料） 文1：分析肌肽对动物糖代谢 近年来随着社会环境及生活方式的改变，生活及工作的压力越来越大，由各种应激源导致的亚健康状态人数也逐年增多。人们长期处于应激负荷状态下容易导致免疫力下降，导致各种疾病的发生。肌肽是一种具备高效生物活性的天然二肽，广泛存在于哺乳动物的肌肉组织和神经组织中[1]。研究结果表明，肌肽具有抗氧化抗衰老功能、神经系统保护作用、抗糖基化作用、对肾中毒及肝损伤有一定的改善作用、可防止动脉硬化等生理活性[2，3]。但尚未见肌肽对应激负荷状态下糖代谢改善作用的报道。本实验通过观察肌肽对拘束负荷小鼠血糖浓度和肝糖原合成的影响，以及小鼠血浆中皮质酮变化，探讨肌肽对应激引起的机体糖代谢紊乱的改善作用。 1材料与方法 试剂 肌肽(carnosine)、皮质酮(corticoste??rone)标准品及氢化可的松(cortisol)标准品为美国Sigma公司产品;乙腈(色谱纯)为Fishecientific公司产品;乙酸乙酯和NaOH为广州化学试剂厂产品;葡萄糖购自天津药业;肝糖原试剂盒购自南京建成科技公司;葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业公司;Trizol购自广州英韦创津生物科技公司;逆转录系统PCR试剂盒均购自北京天根生化科技公司;PCR引物根据GenBank提供的基因序列使用PrimerDesign软件进行设计，引物均由英韦创津公司合成，糖原合酶??2(Gy??2)引物:5′??AACGACAGCCGATGAGT??3′(上游)，5′??CTGGCACGAGAAAGGAT??3′(下游)，其扩增产物长423bp;以18s为内参:5′??GGGAGAGCGGGTAAGAGA??3′(上游)，5′??ACAGGACTAGGCGGAACA??3′(下游)，其扩增产物长241bp。 实验仪器 高效液相色谱系统(日本HITACHI公司);MK3型酶标仪(Labsystem，Finland);3??18K型台式高速冷冻离心机(德国Sartorius公司);2720型PCR仪(美国AppliedBiosystems公司);电泳成像系统(美国Bio??RadLaboratories公司);MilliQPlus超级纯水仪(美国Millipore公司);电泳仪及水平电泳槽为日本Mupid公司产品。 实验动物 体质量18~22g，6周龄SPF级雄性昆明种小鼠32只，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2008??0002。饲养温度(23±2)℃，照明时间12h/d(7∶00~19∶00)，饲养1周后进行实验。 动物分组及给药 将小鼠随机分为正常对照组、拘束应激对照组、150mg/kg及300mg/kg肌肽给药组，共4组，每组8只。肌肽给药组以/10g灌胃给药，正常对照组和拘束应激模型组均灌胃等量空白水，每日1次连续给药7d。除正常对照组外，所有小鼠均在末次灌胃后30min进行拘束应激实验，小鼠拘束装置参照文献[4]制作，为通风良好的50mL尖底聚丙烯塑料离心管，给予一次性拘束20h(12:00~次日8:00)，拘束期间小鼠不能进食饮水。正常对照组小鼠为禁食禁水小鼠。 小鼠糖耐受实验[5] 上述各组实验动物在禁食和拘束结束30min后灌胃葡萄糖2g/kg，口服葡萄糖后0、20、40、60及80min尾静脉取血于肝素钠小离心管中，5000min5min离心，取血浆用葡萄糖测定试剂盒测定血糖浓度。 测定小鼠血浆皮质酮的含量 取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5000min离心5min分离血浆。取血浆，并添加入2mL乙酸乙酯振摇萃取，分离得到上层乙酸乙酯液，下层水液再用乙酸乙酯萃取1遍，合并乙酸乙酯液后用洗1次，再用蒸馏水洗2次。乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后加入100μL流动相(乙腈∶水=38∶72，体积比)溶解即得皮质酮分析样品溶液。按Woodward等人的方法，采用HPLC内标法(内标物为cortisol)测定血浆中皮质酮含量[6]。检测条件为:紫外检测，检测波长为254nm;色谱柱:5C18(×150mm，5μm);流动相:乙腈?菜?(38%∶72%);流速:1mL/min。 肝糖原合成测定 测定血糖浓度后，小鼠在乙醚麻醉下取出肝脏，按肝糖原试剂盒方法测定肝糖原含量。 半定量RT??PCR检测Gy??2mRNA的表达 取肝脏组织，用Trizol