Western实验流程分析和总结.docxVIP

Dept. of Biochemistry Molecular Biology, NJMU. yapworm@ PAGE PAGE 1 RIPA 裂解液 终浓度 母液 10ml 裂解液用量 Tris-HCl PH7.5 50mM 0.5M 1ml NaCl 150mM 0.75M 2ml 脱氧胆酸钠 1% 100%固体 0.1g SDS 0.25% 10% 250ul NP-40 1% 100% 100ul Triton X-100 1% 100% 100ul 去离子水 6.55ml 分装存于-20℃1 年。用前加 100μg/ml PMSF（神经毒，注意防护）和 1% cocktail 30%Acr-Bis 贮液 Acrylamide Bisacrylamide 29g 1g 去离子水定容至 100ml，（过滤），用锡纸避光，4℃保存6 月；神经毒，注意防护 分离胶缓冲液 1.5 M Tris-HCl PH8.8（4℃保存1 年） Tris-base 去离子水 调 PH 值至 8.8，定容至 100ml 18.15g 80ml 浓缩胶缓冲液 1M Tris-HCl PH6.8（4℃保存1 年） Tris-base 去离子水 12.1g 80ml HCl 调 PH 至 6.8，定容至 100ml 10%SDS（室温保存1 年） SDS 去离子水 5g 定容至 50ml 10%AP（4℃1 周） AP 去离子水 0.1g 1ml 电泳缓冲液（4℃保存6 月） 终浓度 5×（1L） 10×（1L） Tris base 2.5mM 15.1g 30.2g Glycine 192mM 72.1g 144.2g SDS 去离子水 0.1% 5.0g 定容至 1L 10g 定容至 1L 转膜缓冲液（1L，4℃保存6 月）；注意甲醇毒性 甘氨酸 Tris-base SDS（分子量30kD 不加） 甲醇 去离子水 2.9g 5.8g 0.37g 200ml 定容至 1L 10×TBST（1L，4℃保存6 月） Tris-base Nacl Tween-20 去离子水HCl 24.2g 80g 10ml 800ml ~13.8ml HCl 调节 PH 至 7.6 定容至 1L 考染液甲醇 乙酸（冰醋酸） 水 考马斯亮蓝 R250 终浓度 50% 10% 定容至 500ml 0.25% 实用 100%原液 100%原液 固体 500ml 加250ml 100ml 1.25g 注 可反复利用 n 次；室温至少 4h 或过夜；若加快染色可37℃ ~1h（50~60℃，~30min） 注意甲醇毒性 0.5ug/ul BSA 10ml BSA 水  50mg 100ml 在 1cm 的比色杯测 A280=3.3（1ug/ul BSA 为 6.6）以鉴定，分装 1ml 冻于-20℃1 年考马斯亮蓝溶液（bradford 液）500ml 考马斯亮蓝 G250 95%乙醇 磷酸 去离子水 50mg 25ml 50ml 定容至 500ml Whatman 1 号滤纸过滤，于 4℃保存6 月 10×丽春红染液三氯乙酸 磺基水杨酸 丽春红 S 去离子水 终浓度 30% 30% 2% 定容至 100ml 实用 三氯乙酸磺基水杨酸丽春红 S 100ml 加 30ml 30g 2g 注：室温保存1 年。用前取 2ml 用去离子水稀释至 10 倍体积，工作液可反复利用而不影响后续。 2×loading buffer SDS 终浓度 实用 4% 固体 5ml 加 200mg 水 3.85ml (PH 6.8 Tris-HCl 加后利于溶解 SDS，SDS+ DTT 增加 150ul 体积） Tris-HCl, PH 6.8 DTT 甘油 120mM 0.2M 20% 1M 固体 100%原液 0.6ml 155.4mg 1ml 注 500ul 分装-20℃保存1 年，融化后 4℃保存2 周~2 月 5×loading buffer Tris-HCl, PH 6.8 SDS 终浓度 实用 300mM 1M 10% 固体 2ml 加0.6ml 200mg 水 0.85ml (PH 6.8 Tris-HCl 加后利于溶解 SDS，SDS+ DTT 增加 150ul 体积） Tris-HCl, PH 6.8 DTT 甘油 150mM 0.5M 50% 1M 固体 100%原液 0.6ml 155.4mg 1ml 注 500ul 分装-20℃保存1 年，融化后 4℃保存2 周~2 月 stripping buffer 50ml（个人修改的 dxy 配方） stripping buffer