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蛋白质等电点测定 蛋白质等电点测定及性质实验 一、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 二、原理： 固体颗粒在液体中为什么能够带电？ 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体 表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。?在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。 根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成 吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的 扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在 扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。 紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式？ ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在 胶粒范围内，约1～100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以 氢键形式与 水分子进行 水合作用，使 水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有 亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性 水分子中的异性电荷吸引形成 双电层。而水合膜和 双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的 胶体溶液。如果消除水合膜或 双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、 肉皮冻就是利用蛋白质的 胶凝作用。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电： 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。 在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。蛋白质在等电点时溶解度最小，最容易沉淀析出。 蛋白质等电点的测定 各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH 12.0~12.4。 本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。蛋白质的等电点比较准确的方法是采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。 等电聚焦 电泳（IEF，isoelectric focusing electrophoresis） 利用特殊的一种 缓冲液（ 两性电解质）在 凝胶（常用 聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个 pH 梯度， 电泳时每种 蛋白质就将 迁移到等于其 等电点（pI）的pH处（此时此 蛋白质不再带有净的正或负 电荷），形成一个很窄的区带。 IEF的基本原理 在IEF的 电泳中，具有pH 梯度的 介质其分布是从 阳极到 阴极，pH值逐渐增大。如前所述， 蛋白质分子具有 两性解