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精品 ABI 测序仪的测序原理和操作规程 ABI 型 DNA 测序仪的测序原理和操作规程 DNA 序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括 Sanger 双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert 化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA 序列分析的主流。 美国 PE ABI 公司已生产出 373 型、 377 型、 310 型、 3700 和 3100 型等 DNA 测序 仪，其中 310 型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是 ABI PRISM 310 型 DNA 测序仪的测序原理和操作规程。 【原理】 ABI PRISM 310 型基因分析仪(即DNA 测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰 胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的 ddNTP(标记终止物法)，因此 通过单引物 PCR 测序反应，生成的 PCR 产物则是相差 1 个碱基的 3末端为 4 种不同荧光染料的单链 DNA 混合物，使得四种荧光染料的测序 PCR 产物可在一根 毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。 由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段 时，激光检测器窗口中的 CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光 分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色 的荧光，并在 CCD 摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为 DNA 序 列，从而达到 DNA 测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基 排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定 DNA 片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。 PE 公司还提供凝胶高分子 聚合物，包括 DNA 测序胶(POP 6)和 GeneScan 胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径 均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、 Macintosh 电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和 仪器运行等软件。它使用最新的 CCD 摄影机检测器，使 DNA 测序缩短至 2.5h，PCR 片段大小分析和定量分析为 10,40min。 由于该仪器具有 DNA 测序， PCR 片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行 DNA 测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段 PCR、RT-PCR(定量 PCR)等分析，临床上可除进行常规 DNA 测序外，还可进行单核 苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、 HLA 配型、法医学上的亲子和个体鉴定、 微生物与病毒的分型与鉴定等。 【试剂与器材】 1(BigDye 测序反应试剂盒 主要试剂是 BigDye Mix，内含 PE 专利四色荧光标 记的 ddNTP 和普通 dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2(pGEM-3Zf (+) 双链 DNA 对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3(M13(-21) 引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即 3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4(DNA 测序模板 可以是 PCR 产物、单链 DNA 和质粒 DNA 等。模板浓度应调整在 PCR 反应时取量 1μl 为宜。本实验测定的质粒 DNA，浓度为 0.2g/L，即 200ng/μl。 5(引物 需根据所要测定的 DNA 片段设计正向或反向引物，配制成 3.2μmol/L，即 3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如 M13(-21)引物， T7 引物等。 6(灭菌去离子水或三蒸水。 7(0.2ml 或和 0.5ml 的 PCR 管 盖体分离， PE 公司产品。 8(3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取 40.8g NaAc?3H2O 溶于 70ml 蒸馏水中，冰醋酸 调 pH 至 5.2，定容至 100ml，高压灭菌后分装。 9(70%乙醇和无水乙醇。 10(NaAc/乙醇混合液 取 37.5ml 无水乙醇和 2.5ml 3mol/L NaAc 混匀，室温可 保存 1 年。 11(POP 6 测序胶 ABI 产品。 12(模板抑制试剂(TSR) ABI 产品。 13(10×电泳缓冲液 ABI 产品。 14(ABI PRISM 310 型全自动 DNA 测序仪。 15(2400 型或 9600 型 PCR 仪。 16(台式冷冻高速离心机。 17(台式高速离心机或袖珍离心机。 【操作步骤】 1(PCR 测序反应 (1) 取 0.2ml 的 PCR 管，用记号笔编号，