实验四PCR产物的T载体克隆和转化演示文稿.pptVIP

2. 蓝-白筛选（α互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。 第二十四页，共三十八页。 α互补筛选（蓝-白筛选） 第二十五页，共三十八页。 第二十六页，共三十八页。 PCR产物的T载体克隆和转化 第二十七页，共三十八页。 志比昆仑 学竞江河 青海大学 Qinghai University 志比昆仑 学竞江河 青海大学 Qinghai University 青海大学 Qinghai University 第一页，共三十八页。 重组DNA技术操作步骤 第二页，共三十八页。 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 第三页，共三十八页。 主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞 ④ DNA重组体的筛选和鉴定 ⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究 第四页，共三十八页。 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 第五页，共三十八页。 （三）PCR扩增特定基因 （四）人工合成 一、目的基因的获得——分 （一）从基因组文库中获得 （二）从cDNA文库中获得 第六页，共三十八页。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 第七页，共三十八页。 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 第八页，共三十八页。 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 第九页，共三十八页。 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 第十页，共三十八页。 几种常用克隆载体的比较 注：+表示可用；-表示不可用 比较内容 质 粒 λ噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体 克隆容量 10 kb 22 kb 40～50 kb 1 kb 基因组DNA文库 - + + - cDNA文库 + + - - 亚克隆 + - - + 序列分析 + + - + E.coli表达 + + - - 二、载体的选