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第八章 蛋白质工程 湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲 第一页，共四十一页。 本章目录 蛋白质工程的理论基础 蛋白质工程的理论基础 蛋白质结构测定与结构预测 蛋白质工程的关键技术 定点突变 定向进化 其他技术 蛋白质工程的应用及实例 定点突变与蛋白质药物工程：胰岛素 定点突变、定向进化与工业用酶：枯草杆菌蛋白酶等 结构域的拼接与金属硫蛋白工程 抗体工程 第二页，共四十一页。 第一节 蛋白质工程的理论基础 蛋白质工程的概念 蛋白质的结构 蛋白质结构预测 第三页，共四十一页。 一 蛋白质工程的概念 基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论或实践活动。 （1）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系； （2）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。 第四页，共四十一页。 二 蛋白质的结构 一级结构：多肽链的氨基酸残基的排列顺序 二级结构：多肽链借助于氢键或离子键沿一维方向排列成具有周期性结构的图象。 三级结构：指整个蛋白质多肽链在二级结构的基础上，侧链基团通过次级键或疏水键的相互作用进一步盘曲折叠，形成具有一定规则的空间结构 。 四级结构：由两条以上的多肽链组成的蛋白质，多肽链之间没有共价键连接而是借疏水作用等次级键缔合在一起形成的高级空间结构 。 第五页，共四十一页。 第六页，共四十一页。 氨基酸的聚合形成肽链 第七页，共四十一页。 肽链的空间结构单元: 二硫键的折叠 第八页，共四十一页。 肽链的空间结构单元 :氢键的折叠 第九页，共四十一页。 肽链的空间结构单元 :离子键的折叠 第十页，共四十一页。 肽链的空间结构单元 每四个氨基酸残基间的 氢键构成多肽链 a 螺旋 第十一页，共四十一页。 肽链的空间结构单元 由不同多肽链上氨基酸残基间的氢键构成多肽链 b 折叠 第十二页，共四十一页。 肽链的完整空间构象 第十三页，共四十一页。 第十四页，共四十一页。 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质一级结构是空间结构的基础，而空间结构决定了蛋白质的功能。 结构域：蛋白质多肽链上一段在三维结构上可以明显区分和相对独立并具有一定生物学功能的基本单位。 模体（基序）：组成结构域的基本二级结构单位 第十五页，共四十一页。 蛋白质的加工修饰 :磷酸化修饰 第十六页，共四十一页。 蛋白质的加工修饰:羧基化修饰 几种参与凝血的蛋白因子（如 VIII 和IV因子）需要在其谷酰胺侧链上的g-羧基化修饰后，才能拥有蛋白酶的活性，这一修饰过程依赖与维生素K 的存在。 第十七页，共四十一页。 蛋白质的加工修饰:甲基化修饰 肌肉中的一些蛋白质以及细胞色素C中的Lys会受到单甲基和二甲基化修饰；钙调蛋白会受到三甲基化修饰；所有C末端以Glu结尾的蛋白质，其Glu会 受到甲基化修饰。 第十八页，共四十一页。 蛋白质的加工修饰: N-糖基化 O-糖基化 糖基化修饰 第十九页，共四十一页。 蛋白质的加工修饰:其它类型的修饰 第二十页，共四十一页。 三 蛋白质的结构预测 一级结构：测序仪与数据库 高级结构预测： X射线晶体衍射法 核磁共振法（NMR） 第二十一页，共四十一页。 蛋白质一级序列数据库 PIR ：由国家生物医学研究基金会（NBRF）建立 MIPS：Martinsried的蛋白质序列研究所收集和处理的蛋白质序列数据 SWISS-PROT?：蛋白质序列数据库，由Geneva大学和EMBL共同合作开发 TrEMBL：翻译的EMBL ?NRL-3D：除序列信息外，也包括对二级结构，活性位点，结合位点和修饰位点等信息。 第二十二页，共四十一页。 第二节 蛋白质工程关键技术 定点突变 定向进化 其他技术 第二十三页，共四十一页。 一 定点突变 寡核苷酸引物介导的定点突变 PCR介导的定点突变 盒式突变 第二十四页，共四十一页。 遗传信息传递的中心法则 DNA（基因） DNA（基因） mRNA 蛋白质 生物代谢物质 复制 转录 翻译 代谢 基因组学 转录组学 蛋白组学 代谢组学 逆转录 中心法则 第二十五页，共四十一页。 1. 寡核苷酸引物介导的定点突变 用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制的过程 寡核苷酸引物介导的定点突变的Kunkel改进 ： 载体：RF－M13DNA载体 菌株：dUTP酶和N－尿嘧啶脱核苷酶双缺陷的菌株。 原理：dUTP酶缺陷导致胞内dUTP上升，部分取代dTTP进入新生DNA链中，使得M13单链DN