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PCR扩增产物的剖析方法 微孔板夹心杂交法 颜色互补剖析法 PCR-ELISA法 PCR-OLA法 PCR-打点杂交法 微孔板夹心杂交法： 该法是经过一固定于微孔板的捕获探针与 PCR产物的某一地区特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一世物素 等 非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物， 因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于 HBV的检测，其敏感度可达 5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR P 32 探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、迅速、防止了同位素标记探针的危害，显色反响近似于临床常 规应 用的ELISA，适于临床实验室惯例应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记 的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节俭了检测时间，因为 膜 杂交过程中，反响剂要浸透膜中，漂洗时，使反响剂全部浸出需 要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需 Dehatdt液和预杂交以及封 闭 过程。此外，微孔板固定的 DNA不需再加热或 UV照射。 微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。 DNA的固定 在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同根源的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列 的盐浓度（L至LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方法的选 择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合适时， DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促使DNA固定的作用，但 它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于300bp，否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。 待固定DNA100℃加热5min变性并立刻冷却。 与合适的固定液混杂后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷酸钠-10mmol/LEDTA，，合适浓度的NaCl（与DNA变性混杂后，终浓度为最适固定浓度）。 用胶布封好，浸于37℃水浴2h。 用%Tween20漂洗3次。 立刻用于杂交，或关闭于塑料袋内保留。 杂交 可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。 显色 根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波长。 颜色互补剖析法(A) 颜色互补剖析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标 记（A片段引物标记绿色的荧光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色（红色或绿色）。 如果两条不同大小的片段均被扩增，可经过电泳分别，紫外激发后可察看到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后 可见一条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分别扩增片段，经过一定手段除未掺入引物，亦可察看到扩增产物的颜色。此时，扩增 产物不论大小，只需均被扩增，便可见一条红绿互补的黄色条带。 该法简易、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情况下，只需判断产物的有无。此外，在检测多 种基因实变、多种病原菌和HLA分型时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM等）。 PCR-ELISA法：(A) 本法防止了电泳和杂交的步骤，适于惯例ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍可进行惯例PCR扩增特异靶序列，因此，能够经过 修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物固定的功能基团，而经过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。 链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差别并不显著。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma企业）用 PBS-Tween液140mmol/LNaCl，LKCl，LNa2HPO4，LK2HPO4，%(w/v)Tween20，配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温留宿。用PBS液漂洗。 扩增产物与包被板的联合：PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。室温下作用30min。用PBS-Tween液漂洗6次， 去除未掺入的荧光引物。ELISA：向联合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-T