pcR引物设计注意事项.docxVIP

ORF(Openreadingframe) 开放阅读框是基因序列的一部分， 包含一段能够编码蛋白的碱基 序列，不能被终止子打断。 CDS(codingsequence)序列是编码序列，是用来编码蛋白质的那 段序列，是mRNA的一部分. 往常外显子指的是编码蛋白序列 .严格地说,外显子是指保存在初级ｍＲＮＡ中不被剪切掉 的地区,包括 5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’UTR)。所以mRNA的外显子的概 念应当要大于 CDS序列的范围 何谓PCRPCR引物设计时有哪些注意事项 1）聚合酶链式反响简称PCR（英文全称：PolymeraseChainReaction）。 2）PCR引物设计原则 1设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物剖析软件将试图经过 使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基来源理： ②引物长度 ②GC含量，一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应当 协调。假如引物存在严重的GC倾向或AT倾向则能够在引物5’端加适量的A、T或G、C尾 巴。 ③退火温度 退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，能够适合提高退火温度，这样可 以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么能够适合减低退火温度，是DNA双链联合。 一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，可是理想情况下一对引物的退火 温度是同样的，能够在55℃～75℃间变化。 ④防止扩增模板的二级构造地区 选择扩增片段时最好避开模板的二级构造地区。用相关计算机软件能够预测估计目的片段 的稳定二级构造，有助于选择模板。实验表示，待扩地区自由能（△G）小于mol时，扩增 往往不能成功。若不能避开这一地区时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 ⑤与靶DNA的错配 ⑥引物尾端 引物3’端是延长开始的地方，因此要防备错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G 或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级构造可能， 除在特殊的PCR（AS-PCR）反响中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码地区，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 引物的二级构造 引物自己不应存在互补序列，否则引物自己会折叠成发夹状构造，这种二级构造会因空间 位阻而影响引物与模板的复性联合。若用人工判断，引物自己连续互补碱基不能大于3bp。 两引物之间不应当存在互补性，尤应防止3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 ⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配 5’端对扩增特异性影响不大，因此，能够被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质联合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额 外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，可是为了下一步的操作就要作出适合的“牺牲”。PCR引物设计的黄金法例1.引物最幸亏模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是经过物种间相像序列的比较确定的。在NCBI上搜寻不同物种的同一基因，经过序列剖析软件（比方DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会致使其延长温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反响。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好靠近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反响。上下游引物的GC含量 不能相差太大。此外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸 的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动 温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好靠近72℃以使复性条件最正确。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码地区，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差别，当末位的碱基为A时， 即便在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 碱基要随机散布。 引物序列在模板内应