qpcr实验从设计primer开始到计算方法详例.docxVIP

虽然关于详细的原理不是特别理解，现把详尽的实验realtimePCR的实验方法写出 来让大家来参照。 第一步：primer设计 Primerdesign: 1.FindoutthemRNAofrelatedgene,forexample:Musmusculus transgelin(Tagln)SM22a,mRNA NucleotideGenBank openthewebsiteofPrimer-Blast accession,gi,orFASTA NCBIReferenceSequnece:,range 2. 3. Writetheorganismthatyouuseformiceforhomosapiens, mice:Musmusculus(taxid:10090) Primerpair1 Sequence(5-3) Templatestrand Length Start StopTmGC%Selfcompl Forwardprimer GCTTTGGGCAGTTTGGCTGT Plus 20 631 650 Reverseprimer TCTTATGCTCCTGGGCTTTCTTCAMinus 24 718 695 Productlength88 Exonjunction698/699(reverseprimer)ontemplate 将设计的primer序列交给企业合成就能够了。提取mRNA 关于组织，如血管。 在冷的PBS液体中取出血管后马上放入液氮中。带全部样品提取完后， 用粉 碎机粉碎。 大体 20次/秒速度，10 秒每次，3次。 2. 加入1mlTrizon, 常温静止30min 3. 放于冰上， 加入200ulchloroform ，震荡混匀。13000rpm,4℃，离心10- 15min 4. 取上清液， 大体500-600ul 5. 加入500ul2-propronaol ，震荡混匀，13000rpm,4℃，离心10-15min。 （因小鼠组织太小， 加入了4ul,precipitation ） 6. 去掉液体， 加入 80%酒精500ul(一定要用无核酸酶的水，PCR用水)，离心 13000rpm,4℃，10-15min ，重复操作2-3次。 去液体，干燥，加入PCR用水，溶解mRNA 测量RNA含量。 定量RNA含量，保证样品中有650ng/ul RT-RCR5*buffer4uldNTP8ulRadomprimer1ulRTace RPI mRNA:6ul 30℃，10min；42℃，60min；99℃，5min；4℃，∞ 达成后稀释样品5倍保留待用。 18s做内参在保留用样品的基础上再稀释 50倍。 Real-timePCR每个样品做1次重复SYBRqPCRmix: ROX:PrimerF:PrimerR: DW cDNA: HOTstart:1min,95℃， 50cycle，Melt:30s,95℃。  1cycle  ；  step:  15s,  95℃；  45s，  60℃， 达成后，ROX做为reference，导出Ct值 最后结果Ct值计算方式例子 如： 获得的值为 sample Target Ct WT1 18s WT2 18s WT3 18s KO1 18s KO2 18s KO3 18s WT1 actin WT2 actin WT3 actin KO1 actin KO2 actin KO3 actin 1.计算  actin  –  18s  值（  ct） sample  actin-18s WT1 WT2 WT3 KO1 KO2 KO3 计算  WTactin-18s  的平均值 WTactin-18saverage  (WT1,2,3actin-18s  平均值  ) 计算各种品  减平均值获得值为（  ct  ） sample  Actin-18s-(WTactin-18saverage) WT1 WT2 WT3 KO1 KO2 KO3 ct 计算2^ WT1 WT2 WT3 KO1 KO2 KO3 计算平均值，算标准差即可 此处KO3肯定是个异样值，忽略不计 的表格如下 作t-test，p=