基因克隆与表达的载体.pptxVIP

第三章 基因克隆与表达的载体;基因克隆过程;在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。;1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries. ; （2）在宿主细胞内能独立复制。 replicate independently in host cell;复制位点 选择性标记 克隆位点; 基因工程中常用的载体有4类?? ;第一节 克隆载体 ;大肠杆菌的质粒;质粒的命名规则;构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构;（1）分子小： ;（二） 质粒的一般生物学特性;（4）质粒的空间构型：;③ 线形DNA （ linear ，lDNA）;（5）质粒空间构型与电泳速率;（三）质粒的基本性质; 2. 不相容性（incompatibility）;在大肠杆菌中的质粒，可以分为： ;如：F质粒（性质粒、或F因子）：;大肠杆菌接合（conjunction）;;（ 2）非接合型质粒（non-conjugative plasmid ）;;带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因;（1）如：分子量大，拷贝数低;;ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）;2、质粒载体的构建：;第30页/共244页;（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数;氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）; 常用抗生素的抗性原理;ii）氯霉素（Chloramphenicol，Cml）;iv）链霉素（Streptomycin，Str）;;;② 遗传标记;第39页/共244页;当带有抗生素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;4、人工构建的质粒载体的类型;Plasmid amplification;（2）低拷贝数的质粒载体;（3）失控的质粒载体;（4） 插入失活型质粒载体;（5）正选择的质粒载体;（6） 表达型质粒载体;复制起始点ORI 选择标记 多克隆位点MCS; 质粒载体的选择;（五）经典的大肠杆菌质粒载体;6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。;2. ColE1;① colicin E1基因的结构;EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。;;复制位点 选择性标记 克隆位点;严紧型： 松弛型：;不相容性;人工构建的质粒载体的类型;人工构建的质粒载体的类型;理想质粒载体应具备的条件;经典的大肠杆菌质粒载体;经典的大肠杆菌质粒载体;pSP2124质粒的Ampr基因;;;（5）pBR322的优点;外源基因?BamH I;氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000 copy，达细胞DNA总量的40~50％;（6）pBR322的缺点;4. pUC系列;① 复制起点;（2）长度;pUC18/19;;Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。;?-半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。;③ lacZ的?肽互补;2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）;pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与受体菌缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，形成4聚体，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。;4）?互补的插入失活;④ IPTG的诱导作用;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;无质粒的 受体菌;;（5）pUC系列载体的优点;Promega 公司的T载体系列;T vector的克隆过程－简便！;（六）其它重要的质粒载体;（六）其它质粒载体;① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以体外转录mRNA;3. 穿梭质粒载体;Yeast复制起点;第94页/共244页;（3）穿梭载体的优点;（ 七）质粒载体的不稳定性;有主动分配和随机分配两种假说。;人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。;在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。;