功能基因的序列比对方法.pdfVIP

功能基因的序列比对 1.切除载体和(或)引物 a.翻开所有的原始引物序列于一个EditSeq 的窗口中 b. export all as one c.保存 d.翻开这个保存的文件，开始切除载体和引物 e.选择载体插入点两侧的序列(10-15 个的样子)搜索 注意：不存在正反向的问题，都是一个 方向，因为测序的时候是选择两个载体上的引物其中的一条来往后测序的！ 切完之后另存为 f. 重新翻开这个文件，开始切除引物 方法同切载体，但是要注意正反向的问题。比方mcrA 基因，其引物为 Forward: 5-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-3 Reverse: 5-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3 先找Forward 5’端，此时只找到的局部序列。切去5’端。 然后再切这些切掉5’端序列的3’端的序列，此时其3’端序列应该是Reverse 的反向互补序列。 切去这个反向互补序列，这样一来这个些序列就已经被切去两端的引物了。 但此时还剩下另一局部未切除任何引物的序列，此时记下这些序列的编号，先切去Reverse 5’ 端。 再用Forward 的反向互补序列切去3’端，这样剩下的序列也都被切除两端的引物了。 2将所有序列调整为同向序列： a. 选择前面记录编号的序列，将这些序列一个个都转换为其反向互补序列。这样一来所有 的序列都成为同向序列了，即在DNA两条反向互补链的其中一条上的比拟了。 b. 保存该文件 3 生成OTUs Google 搜索〞Fastgroup II〞 或 ://fastgroup.sdsu.edu/fg_tools.htm (Online grouping--注意勾选的选项) Choose method 里面相似度可以选97%或98% 提交之后出现的窗口如 可以看到被分为了10 个OUT 每个OUT 都自动选择了一个代表序列。全选将其复制到word 中，备用。并把其中的那些代表序列都复制下来粘贴到TXT 保存。 4 寻找嵌合体: 一般是对16S rRNA 来说的 两个网站： ://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html (或搜decipher chimera) ://comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl ( 或搜 bellerophon chimera check) 5翻译 网站： ://pfam.sanger.ac.uk/ 在保存有OTUs 的TXT 文件中，一个一个翻译成蛋白质序列。最后保存。 在用Expasy翻译的时候选择第二个选项 点击翻译 理想的情况是这段序列中应该是没有终止序列的即〞-〞符号，因此先选择阅读框较长，整 段序列也没有终止子的那些，如图，先选择第二个。复制红色的区域，在blast上比对，看 是否是需要的序列，如果是。那么就选择此结果，如果不是，再一一比对其他的罗列结果。 或者直接将DNA序列提交到sanger上，出现如下结果 Frame2 中有一段绿色，显示就是mcrA的保守家族。那么Frame2 即为正确的翻译方法。 另存为，只保存pro的序列的TXT 改名为.FAST格式 6寻找最相似序列 翻开这个FAST文件，开始一个个找最相似序列了。 在这个窗口，开始blast。找到一个序列后复制其DNA的编号 点击这个按钮 出现这个窗口 把复制的DNA编号手动输入 点击OK 那么这个序列被自动添加到了FAST文件里了。 一般一个序列寻找3个相似度不等的序列。 最后，保存为一个新的FAST文件。 7画系统发育树 翻开前面的FAST文件，全选文件〞W〞一下，再直接点OK 左右两头各删除带*之前的序列，另存为新的FAST文件。 翻开这个FAST文件开始画树。 8最后对画的树进行一些修饰。