DNA测序分析常见问题整理课件.pptxVIP

Applied Biosystems 3730/3730xlDNA AnalyzersDNA测序分析常见问题整理测序结果—峰图四色图谱：每一种颜色对应一种碱基ATCG 影响测序质量的主要因素 引物 DNA模板 纯化 困难模板 机器影响 一、引物对测序结果的影响① 引物合成时多（少）一个碱基② 引物不纯③ 模板上没有引物结合位点④ 引物二聚体⑤ 双引物结合合成时部分引物多一个碱基合成时部分引物少一个碱基● 现象：每个峰后面有个同样荧光信号的小“尾巴”。● 原因：合成时引物多一个碱基。● 对策：重新合成引物● 现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。● 原因：合成时引物多一个碱基。● 对策：重新合成引物引物（模板）不纯● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰）● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质● 对策：–建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。–脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。模板上没有引物结合位点● 现象：没有特异性的测序峰图● 原因：引物无法结合模板● 对策重新设计引物引物二聚体● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚体片段小大在100bp左右）● 原因：引物二聚体未去除干净● 对策：割胶纯化双引物结合● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套峰● 原因：模板有两个引物结合位点，同时和两个引物结