临床样本的采集、运输和保存及核酸提取.pptVIP

RNA提取实验前的准备 【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用0.1%DEPC水溶液在37℃处理12h，后120℃高压30min，去除残留DEPC 【试剂配制】 无菌水须用0.1%DEPC处理后高温高压灭菌 RNA实验试剂应RNA提取专用，避免其他试剂交叉污染 【其他】 实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在RNA专用区操作，操作过程中避免交谈… … 表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法： 每mg组织中加入1mlTrizol试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器） 加入氯仿0.2ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分层。 高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 吸上清液至新离心管中，约600ul 加入500ul异丙醇，混匀，室温静置10分钟 高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 弃上清液，沉淀为RNA 加入1mlDEPC处理的75%乙醇，混匀，7500rpm离心， 4-8°C，5分钟 加入DEPC处理水30ul，混匀，55-60 °C水浴 3ul加入297ulDEPC水，测定浓度和纯度 异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法 试剂的作用： 加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活 （四）、mRNA的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly（A）尾巴 利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA The End! 谢谢观看/欢迎下载 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 内容总结 临床标本的采集、处理、运送与保存及DNA/RNA提取。所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下进行。每μg核酸标本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性。做血红蛋白电泳常温1周，电泳4℃可保存15天。核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。5、核酸的贮存——DNA保存。4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。核酸的贮存——RNA保存：。.R蛋白质复合物，使蛋白质变性。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能。苯酚溶于有机溶剂，微溶于水。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。DEPC水制备：0.1%DEPC在37°C处理1h，并高压灭菌15min。谢谢观看/欢迎下载 三、基因组DNA的分离与纯化 （一）、DNA样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮 DNA提取前样本采集、预处理和保存： 全血 抗凝剂： EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素 抗凝剂处理血 肝素 柠檬酸* EDTA* -80℃ 保存2个月，第10天收率90% 4 ℃ 第四天收率90% 第10天提取效果差 第十天收率85% 室温 提取效果差 第四天收率90% 第十天提取效果差 （二）、DNA提取 （一）酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。 酚 抽 提 法 提 取 步 骤： DNA酚抽提法示意图 主要试剂的作用： EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性 SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性 蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用 苯酚： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水