ELISPOT技术原理及其应用.pptVIP

酶联免疫斑点Enzyme Linked ImmunoSPOT;ELISPOT技术起源与开展 细胞与细胞因子 ELISPOT技术原理 ELISPOT 和 ELISA的区别 ELISPOT的优点;1983年, CzerkinskySedgwick ：计数分泌抗体的 B 细胞； 1985年，More：NC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶; 1988年，Czerkinsky et.al.: 首次将应用扩展到细胞因子检测领域，T cell IFN-γ; 同年业开展出双色标记技术； 1995年，Schielen et.al.: 首次将PVDF膜板引入ELISPOT 1997年，Gui et.al.：开展出计算机辅助的斑点技术技术。;T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞Th。它们参与了细胞免疫(Th1)和体液免疫(Th2) 抗原或者有丝分裂原刺激T细胞、单核/巨噬细胞分泌细胞因子 Th1 cells ? IFN-γ,IL-2 Th2 cells ? IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells ? IFN-γ, TNF-β, 颗粒酶B，穿孔素 单核/巨噬细胞 ? TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。;用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。;4.ELISPOT 和 ELISA的区别;5.ELISPOT的优点;在106抗原呈递细胞〔APC〕中混入数量的IFN-γ阳性T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。;第二局部：技术特点;包被抗体 4℃ 过夜，洗涤； 封闭37 ℃ 1h； 参加淋巴细胞和刺激原37 ℃孵育8-40h； 冰水裂解并移出细胞，洗涤； 参加生物素标记的检测抗体37 ℃ 1h，洗涤； 参加酶联亲和素37 ℃ 1h，洗涤； 参加显色底物，显色10~40min； 获得斑点，计数。;2. ELISPOT技术要点;塑料板：U-cytech公司特有的透明版 操作简单，方便，省时，价廉，但是斑点不如膜板漂亮，适于初学者以及临床诊断。 膜板：PVDF膜板、NC膜板 操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者以及科学研究。;塑料板：U-cytech公司特有的透明版;膜板：PVDF膜， NC膜;IFN-?;4. 膜结构和抗体包被;从外周血提取淋巴细胞时, 应防止凝血引起的细胞活性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6小时。 只能采用淋巴细胞提取液别离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰 从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，参加ELISPOT培养孔的??胞须为单细胞悬液 预培养的淋巴细胞假设有坏死/凋亡〔培养液变黄〕会影响斑点的形成 预培养后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液;6. 有血清与无血清;;8.建立阳性对照;阳性对照实例;9.调整适当的细胞浓度;10. 预培养法与直接法;直接法PVDF 刺激物：ICE Peptide Pool 40 Hours,2 X 105 Cell/ Well;直接法PVDF 刺激物：破伤风杆菌 40Hours, 2X105Cell/Well;11.各种染色系统;第三局部：常见问题; ;斑点过密，细胞数量过多;斑点聚集在孔边缘问题;这是震动所导致的斑点拖尾;5. 透明板“空斑〞问题;我们自己的一个例子〔透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白〕;6.斑点明显偏大，并且弥散;斑点偏大，弥散：我们自己的例子〔透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白〕;7. PVDF膜酒精预湿处理问题;一个客户的实例;细胞凋亡是高背景、无斑点的重要原因 如果有30％细胞凋亡，完全不会出斑点；即使5％凋亡，也有严重影响 对策： 台盼蓝活细胞计数 复苏冻存的细胞，可以先培养过夜，再做ELISPOT实验;第四局部：ELISPOT应用;国外ELISPOT应用;ELISPOT在国内的应用;ELISPOT在HIV疫苗研究中的应用;ELISPOT在HIV根底研究中的应用;ELISPOT在I-型糖尿病诊断中的应用;ELISPOT在乙肝诊断中的应用;PubMed年度收录ELISPOT相关论文的数量变化 ;谢谢大家！