种质离体保存.pptxVIP

种质离体保存;种质资源保存方法;第一节 概 述;二、超低温保存的概念; 但对植物而言,低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如 果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度,就会致使植物细胞遭 受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6、5℃,枳壳 通常在-20℃左右(沈德绪等,1986)。;低温保存(Cryopreservation),是指将植物的组织或细胞经过防冻处理后,在低于-80℃条件下保存的方法。 超低温保存:将植物的组织或细胞经过防冻处理后,在-196℃的极端低温下保存的方法。;超低温保存的优点:;超低温保存的意义:; 常用的超低温保存方法: 冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法 玻璃化处理的超低温保存法;三、超低温保存的研究概况;第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础;1、细胞内外水分的冻结特性;依照Luyet的冻结理论(1937),细胞内游离水的冻结温度(-30℃)可认为是细胞冻存的安全温度,因而细胞冻存的两步冻结法一般以-30℃为基础的。 也就是说,控制细胞内外水的冻结状态,是细胞冻存技术的关键。;超低温保存的原理;依照细胞内外水分的冻结特性,冻存方法有:;2、低温下细胞的致死损伤;第三节 超低温保存的方法;一、传统的降温冰冻方法 1、慢冻法:以0、5-2℃/min速度降温至-100℃后投入液氮,或以该速度一直降温至-196℃后投入液氮。 在冰冻保保护剂的作用下,既可幸免在细胞脱水时细胞内产生冰 晶,又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应”。因此,关于原生质 体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物,这种方法效果最好。;2、快冻法:将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直截了当投入液氮或液氮的蒸气相中,该方法对高度脱水的材料如种子、花粉及抗寒性特别强的休眠枝条或冬芽比较适宜,对含水量高的细胞培养物则不适合。;3、分步冰冻法:是慢冻法和快冻法的结合,先用较慢的速度(0、5 ～ 4℃/min)降至-30～-40 ℃,停留0、5～1h,然后直截了当投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分结冰,对细胞进行保护性脱水,幸免细胞内产生非均一性冰晶。;4、 干冻法:将样品在高浓度(0、5-1、5M)渗透性化合物培养基上培养数小时至数天,再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数小时(使含水量降至17～40％)或用藻酸盐包埋后投入液氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、茎尖、生根苗保存,但不适用于脱水敏感的材料。;二、玻璃化保存方法 玻璃化(vitrification)是指液体转变为非晶体玻璃态的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径:一是大幅度提高冷却速率;二是增加溶液浓度。;1、玻璃化法 玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化溶液快速脱水 后,直截了当投入液氮,使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻璃 态。在此过程中,水分子没有发生重排,不形成冰晶,不发 生结构和体积的改变,因而可不能对材料造成机械损伤。当保 存终止后,通过快速化冻防止去玻璃化的发生。假如材料能 够安全度过冷却和化冻两个关口,冻存即告成功。;2、包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合。 先把保存材料用藻酸钙包埋,再经蔗糖浓度梯度脱水和玻 璃化溶液处理后投入液氮保存,其存活率比包埋脱水法要高, 估计是因为藻酸钙的包埋减轻了玻璃化溶液的毒性。;包埋玻璃化的实例;第四节 影响超低温保存效果的因素;一、材料的基本特性;二、预处理和低温锻炼;三、冰冻保护剂的应用;渗透型冰冻保护剂;非渗透型冰冻保护剂;四、解冻方法;　另外,不同材料或方法采纳的化冻方式也有不同: 材料含水量:液泡小、含水量少的细胞(如茎尖分生组织),可采纳快速化冻的方法;液泡大、含水量高的细胞则一般需要采纳慢速化冻法。 材料的生理状态:生长季节中的材料,一般在37～45℃温水浴中快速化冻(500-700℃/min)比在室温下慢速化冻要好,而木本植物的冬芽,在超低温保存后,必须在0℃低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。 保存方法:玻璃化冻存的材料在保存终止后,要求快速化冻,以防止次生结冰对组织细胞造成伤害。;1、 冷冻保存后细胞和器官活力的检测;　　经冻存的材料,不可幸免地受到一些伤害,需要小心维护: 培养:一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-2周,再转入正常光照下培养。 培养基:一般是保存前使用的培养基,但有时需将大量元素或琼脂含量减半,或在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等,以利于材料的恢复生长。 ;六、超低温保存中变异及其检测; 为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况,有必要在保存材料的恢复和再生时期建立有效的检测体系。目前,形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记(如RFLP和RAPD)等检测方法常常单独或结合