临床免疫学检验：免疫原和抗血清的制备.pptVIP

一、佐剂的种类 具有免疫原性的佐剂: 细胞因子、细菌及代谢产物（如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、 LPS ） 无免疫原性的佐剂：液状石蜡、羊毛脂、氢氧化铝、明矾、矿物油以及人工合成的多聚肌苷酸∶ 胞苷酸(poly I∶C)、脂质体 常用于动物实验的佐剂： 福氏佐剂(Freund’s adjuvant) 福氏不完全佐剂：羊毛脂+液体石蜡 福氏完全佐剂：弗氏不完全佐剂+卡介苗 乳化方法： 研磨法和搅拌混合法 乳化效果 二、佐剂的作用机制 改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。 刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。 刺激淋巴细胞增殖和分化。 第三节 抗血清的制备  抗血清的制备是将免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体 多克隆抗体的产生示意图 多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物 一、免疫动物的选择 抗原来源与动物种属的关系 种属差异越远，免疫原性越强 动物个体的选择 适龄、健康、体重符合要求 抗原的性质 二、免疫程序 免疫原的剂量 中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 免疫间隔时间 第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天 免疫途径 皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结 三、动物采血法 颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊 第四节 抗血清的纯化 抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物， 除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。 纯化目的是除去这些不相关成分,防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。 一、 IgG类抗体的纯化 盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层析柱 第五节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法 抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验 二、抗血清的保存 2℃～8℃保存：短期保存 冰冻保存：保存5年 真空干燥保存：保存5～10年 二、特异性抗体的纯化 有时由于免疫原的不纯，含有性质相近的杂抗原，可导致免疫血清中存在杂抗体，为得到单价特异性抗血清，可用亲和层析法和吸附法去除杂抗体。 亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗原混合液制成固相吸附剂 1．什么是免疫原？ 2．如何制备可溶性抗原？ 3．常用的细胞破碎方法有哪些？ 4．连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方法有哪些？ 5．纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？ 6．什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的作用机制有哪些？ 7．什么是抗血清？什么是多克隆抗体？ 8．如何制备抗血清？ 9．动物采血有哪些方法？ 10．抗血清的鉴定包括哪些内容？ 思考题 小 结 免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质，与载体结合后可具有免疫原性。 免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。 特异性IgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。 免疫原和抗血清的制备 第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备 第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制 第三节 抗血清的制备 一、免疫动物 二、免疫方法 三、动物采血法 第四节 抗血清的纯化 一、特异性抗体的纯化 二、IgG类抗体的纯化 第五节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存  第一节 免疫原的制备 免疫原(immunogen)