临床免疫学检验：第13章 免疫细胞分离与功能检测及其应用.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第四节 淋巴细胞功能检测 一、T细胞功能检测 T细胞分泌功能测试 细胞因子的测定（见后面章节） 第四节 淋巴细胞功能检测 一、T细胞功能检测 T细胞介导的细胞毒试验 CTL细胞杀伤靶细胞 第四节 淋巴细胞功能检测 一、T细胞功能检测 T细胞介导的细胞毒试验 CTL细胞杀伤靶细胞 方法 形态学方法 MTT法 51Cr释放法 第四节 淋巴细胞功能检测 一、T细胞功能检测 51Cr释放法 g计数仪 第四节 淋巴细胞功能检测 一、T细胞功能检测 体内试验 皮肤试验-迟发型超敏反应 结核菌素试验 各种皮肤试验 第四节 淋巴细胞功能检测 二、B细胞功能检测 溶血空斑试验 SRBC+致敏脾细胞产生的抗体+补体=溶解空斑 结核菌素试验 第四节 淋巴细胞功能检测 二、B细胞功能检测 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 包被抗原+抗体生成细胞+酶标二抗+底物=颜色深浅 第四节 淋巴细胞功能检测 二、B细胞功能检测 酶联免疫斑点试验 包被抗原+抗体生成细胞+酶标二抗+底物=颜色深浅 第四节 淋巴细胞功能检测 三、NK细胞功能检测 人NK---K562细胞；小鼠NK---YAC-1细胞 方法 形态学法 酶释放法（乳酸脱氢酶，LDH） 51Cr释放法 第五节 其它免疫细胞功能检测 吞噬细胞功能检测 趋化功能检测 方法 - 滤膜渗透法 第五节 其它免疫细胞功能检测 吞噬细胞功能检测 趋化功能检测 方法 - 滤膜渗透法 第五节 其它免疫细胞功能检测 吞噬细胞功能检测 趋化功能检测 方法 - 琼脂糖平板法 第六节 临床应用 全面反映细胞免疫状态 计数 技术成熟，常用 CD4/CD8比值 升高：自身免疫性疾病 降低：病毒感染（AIDS）、恶性肿瘤、再障 注意：1.与患者免疫功能不完全相符 2.只是外周血细胞计数 3.数量的差别不能准确反映功能的差别 4.实验误差 功能 总 结 全面反映细胞免疫状态 T细胞 数量 功能 CD4+---CD3+CD4+CD8- CD8+---CD3+CD4-CD8+ Treg---CD4+CD25+Foxp3+ Th---CK测定 Tc---细胞毒试验 体内试验 外周血 PBMC分离 MACS 体外 增殖试验 思考题 熟悉T细胞及亚群分离、定量和功能检测的方法、基本原理和临床应用。 熟悉B细胞、NK细胞、巨噬细胞等检测方法的基本原理和临床应用 * * * * * * * * * * * * * * * * * * 免疫细胞分离与功能检测及其应用 * 第一节 免疫细胞的分离 第二节 淋巴细胞表面标志的检测 第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测 第四节 淋巴细胞功能检查 第五节 其他免疫细胞功能检测技术 第六节 临床应用 主要内容 概 述 1.免疫细胞与细胞免疫 概 述 1.免疫细胞与细胞免疫 第一节 免疫细胞的分离 1.外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC） 组成 淋巴细胞 90%～95% 单核细胞 5% ～ 10% 比重：1.075～1.090 红细胞比重：1.093 粒细胞比重：1.092 第一节 免疫细胞的分离 1.外周血单个核细胞的分离 Ficoll分离液密度梯度离心法 Ficoll分离液 聚蔗糖-泛影葡胺 比重：人 1.077；小鼠 1.085 密度梯度离心 2000rpm 20min 第一节 免疫细胞的分离 2.淋巴细胞的分离 PBMC去除单核细胞 贴壁粘附法 塑料或玻璃培养瓶孵育1小时 缺点：B细胞有所损失 吸附柱过滤法 _ 玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10层析柱 _ 单核巨噬细胞树突状细胞B细胞T细胞=红细胞 第一节 免疫细胞的分离 3.T、B细胞和T细胞亚群的分离 T、B细胞的分离 尼龙毛分离法 本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。 第一节 免疫细胞的分离 3.T、B细胞和T细胞亚群的分离 T细胞亚群的分离 磁性微球分离法 磁性微球 免疫磁珠 第一节 免疫细胞的分离 3.T、B细胞和T细胞亚群的分离 T细胞亚群的分离 磁