刺梨GGP和DHAR基因序列多态性及其与果实维生素C含量的关联分析.docxVIP

刺梨GGP和DHAR基因序列多态性及其与果实维生素C含量的关联分析 　　摘要：高含量的维生素c是刺梨果实的重要性状，挖掘与维生素c含量相关联的基因序列变异及单倍型对刺梨的品种改良具有指导意义。在21份野生刺梨资源中对ggp和dhar基因进行pcr扩增和测序，分析基因序列多态性及其与果实维生素c含量的相关性。ggp基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为2035bp的同源序列，其中包含22处变异位点，产生15种单倍型，在0.01显著性水平上，3个单核苷酸多态性（snp）及hap15与刺梨果实高含量维生素c相关;在0.05显著性水平上，3个snp及hap7与刺梨果实低含量维生素c相关;ggp基因单倍型存在网状进化。dhar基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为1609bp的同源序列，其中包含69处变异位点，产生9种单倍型，在0.05显著性水平上，8个snp、9个indel及hap9与刺梨果实中低含量维生素c相关，1个snp及单倍型hap4～hap6与刺梨果实中高含量维生素c相关;dhar基因单倍型呈现扇形进化。ggp基因具有更高的单倍型多样性，dhar基因具有更高的dna多态性;ggp基因特异单倍型hap15和dhar基因特异单倍型hap4共同存在于刺梨中时，可以使果实维生素c含量表现为高的状态;而ggp基因特异单倍型hap7和dhar基因单倍型hap9同时存在于刺梨中时，可以使果实维生素c含量表现为低的状态。 　　关键词：刺梨;维生素c;ggp基因;dhar基因;基因序列多态性;单倍型;关联分析 　　中图分类号：s661.203.2文献标志码：a 　　文章编号：1002-1302（2020）08-0063-07 　　收稿日期：2019-03-08 　　基金项目：国家自然科学基金（编号;贵州省大学生创新创业训练计划（编号：2018053）;贵州大学srt计划（编号：2018244）。 　　作者简介：李广贵（1996—），男，贵州六盘水人，主要从事刺梨分子育种研究。e-mail：1119366514@。 　　通信作者：鲁敏，博士，副教授，主要从事果树生物技术与遗传育种研究。e-mail。 　　刺梨（rosaroxburghiitratt.）为蔷薇科蔷薇属植物，原产于中国，因果实富含维生素c而成为研究维生素c代谢的热门材料。研究表明，在所有合成路径中，l-半乳糖途径的gdp甘露糖表异构酶（gme）基因的表达变化最能反映维生素c积累速率的变化;超量表达rrgme基因的拟南芥叶片中维生素c平均浓度提高了6.2倍;而循环途径的脱氢抗坏血酸还原酶（dhar）基因的表达变化与维生素c的积累变化相似性最高，超量表达rrdhar的拟南芥叶片中维生素c平均浓度提高了9.7倍[1]。笔者所在课题组研究发现刺梨中l-半乳糖途径的半乳糖醛酸内酯脱氢酶（gldh）和gdp半乳糖磷酸化酶（ggp）基因的表达特点与维生素c积累高度一致，进一步将它们在烟草中过量表达使烟草叶片中的维生素c含量分别提高了1.1倍和20倍[2-4]。从受体植物维生素c含量的增加程度来看，rrggp和rrdhar等2个基因应优先当选为刺梨维生素c代谢的关键酶基因，但有关它们在基因序列上的差异与维生素c含量之间的关联关系并不清楚。 　　关联分析（associationanalysis）是一种以连锁不平衡为基础，研究群体基因型多态性与表型变异相关性，发掘和定位基因，并对基因及其等位基因进行功能分析的重要工具[5]。根据扫描范围，关联分析可分为全基因组和候选基因2种途径。汤佳乐等利用70对覆盖全基因组的ssr引物，发现了与猕猴桃叶片及果实中的维生素c含量关联的5个优异标记位点[6]。笔者所在课题组虽然前期也开发了大量ssr引物[7-11]，但由于缺乏刺梨遗传连锁图谱数据，因此在ssr引物的选择上具有随机性，目前尚未筛选到与刺梨维生素c含量相关联的ssr标记位点。针对这种现状，候选基因关联分析是更适合刺梨的研究策略。而在苹果上已有研究证明，ggp基因内的单核苷酸多态性（snp）是影响果实维生素c含量的主要决定因素[12]。因此，本研究对候选基因rrggp和rrdhar进行基因序列多态性分析，并进一步与维生素c含量进行关联分析，为刺梨遗传改良提供理论依据和分子工具。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　试验于2017、2018年8—9月进行。从贵州省11个县（市）采样20份，四川省冕宁县采样1份（表1），样本间距离大于50m。每个采样株均有全球定位系统（gps）定位，并详细记录经度、纬度、海拔高度。每株采取幼嫩叶片和成熟度及大小一致的有代表性的果实，以株为单位