食品微生物限度检查标准操作规程.doc

PAGE 93 - 微生物限度检查法 一 细菌、霉菌和酵母菌计数 1 简述 细菌，霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据。 细菌、霉菌、酵母菌计数除另有规定外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。 一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。 在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以 免产生实验误差。 2 设备、仪器及用具 2.1设备 2.1.1 无菌室 2.1.1.1 结构和要求 无菌室应采光良好，避免潮湿，远离厕所及污染区（面积不超过10m2，高度不超过2.4m）由缓冲间（2个）、操作间组成。 操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁，天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。 无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（2～2.5w/m3）,并应定期检查辐射强度，在操作面上不得低于40uw.cm-2。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。 温度、湿度 室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果故温度应控制在18～26℃，相对湿度45～65%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯，空气洁净级别不同的相邻房间的静压差应大于5 Pa，洁净室与室外大气的静压 差应大于10Pa。 2.1.1.2 操作间 操作室应安装空气除菌过滤的单相流空气装置，洁净度不应低于10000级，局部净化度为100级，并准备药物天平、乙醇灯、火柴、75%乙醇棉、碘伏棉等。 2.1.1.3 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂务。 2.1.1.4 洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测定方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 结晶级别 尘粒数/ m3 浮游菌（个）／m3 沉降菌（个）／（∮ 90mm.0.5h） 微粒直径 ≥0.5μm 微粒直径 ≥5μm 100级 10000级 100000级 ≤3，500 ≤350,000 ≤3,500,000 ≤0 ≤2000 ≤20,000 ≤5 ≤100 ≤500 ≤1 ≤3 ≤10 沉降菌数测定（II法） 无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长）以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、 中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。 有条件的单位，同时应检查无菌操作间和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。如菌落数或尘粒数超标，应清洗净过滤系统中的过滤器，必要时予以更换处理。 2.1.1.5 消毒处理 在每次操作前、后，用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。 2.1.2 阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。 2.1.3 无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公间等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。 2.2 仪器 2.2.1 恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（20～25℃）微波炉、匀浆仪（3000～8000r/min）或康氏震荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、离心机、离心管、0.45μm滤膜及滤膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定。 菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平或天平（感量0.1g），PH系列比色计。 2.2.2 玻璃器皿 锥形瓶（250～300